專利名稱：皮膚材料及其制備方法
皮膚材料及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本是發(fā)明涉及生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，特別是一種皮膚材料及其制備方法。
背景技術(shù)：
皮膚是人體最大的器官，覆蓋全身，使體內(nèi)各種組織和器官免受物理性、機械性、 化學(xué)性和病原微生物性的侵襲，具有重要的生理功能。由于炎癥、潰瘍、燒傷等因素造成的 皮膚損傷，嚴(yán)重的可危及生命。 目前的臨床治療方式有自體皮膚移植、異體皮膚移植以及異種皮膚移植。通過皮 膚移植可以挽救病人生命、并有助于創(chuàng)面愈合。表皮干細(xì)胞(ESC)等干細(xì)胞移植治療，在正 常情況下，保證了皮膚的微環(huán)境和毛發(fā)生長，在組織損傷后參與其修復(fù)，同時其也是潛在的 多能干細(xì)胞，完全可以利用其構(gòu)建出具有完整表皮、真皮、皮膚附屬器的功能健全的人工皮 膚，實現(xiàn)創(chuàng)面由暫時性解剖修復(fù)向功能永久性修復(fù)的轉(zhuǎn)變。 當(dāng)燒傷面積超過50%時，由于自體皮膚來源有限，因此在大多數(shù)情況下無法應(yīng)用 自體皮膚移植，而且自體皮膚移植給患者造成新的創(chuàng)傷，治療費用巨大。盡管異體皮膚移植 和異種皮膚移植可以克服以上問題，充當(dāng)臨時的傷面覆蓋物，但是伴隨移植會產(chǎn)生排斥反 應(yīng)和可能的一些移植疾病。盡管組織工程皮膚是最先進(jìn)的組織工程產(chǎn)物，但是它缺乏天然 組織的功能?；蛑委煹姆椒ㄍㄟ^賦予新的功能以及提高細(xì)胞的功能，可以用來制造新一 代皮膚替代物。 盡管干細(xì)胞移植治療和基因治療等方法在臨床應(yīng)用上已經(jīng)取得了巨大的成功，但 是仍有問題未能很好的解決，在愈合過程中由于細(xì)胞之間的生長和分化缺乏正確的誘導(dǎo)， 植入的細(xì)胞和新生細(xì)胞及周邊的健康細(xì)胞之間的生長不同步，因而無法產(chǎn)生正常的皮膚附 屬物。

發(fā)明內(nèi)容
基于此，有必要提供一種能夠調(diào)控細(xì)胞生長和分化的皮膚材料。 此外，還有必要提供一種能夠調(diào)控細(xì)胞生長和分化的皮膚材料的制備方法。 —種皮膚材料，包括生物材料和攜帶光敏感基因和目的基因的細(xì)胞，所述細(xì)胞接
種于所述生物材料中。 在優(yōu)選的實施例中，所述細(xì)胞為自體細(xì)胞、異體細(xì)胞或自體細(xì)胞和異體細(xì)胞的混 合物。 在優(yōu)選的實施例中，所述細(xì)胞為表皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、干細(xì)胞或前體細(xì)胞。
在優(yōu)選的實施例中，所述光敏感基因包括興奮型通道蛋白基因和/或抑制型通道 蛋白基因。 在優(yōu)選的實施例中，所述興奮型通道蛋白基因為ChR2、 ChR2-310、 Chop2或者 Chop2-310 ;所述抑制型通道蛋白基因為NpHR。 在優(yōu)選的實施例中，所述目的基因為人生長激素、表皮生長因子或成纖維細(xì)胞生
3長因子。 在優(yōu)選的實施例中，所述生物材料為可降解型生物材料或非降解型生物材料。 在優(yōu)選的實施例中，所述可降解型生物材料為家蠶絲或柞蠶絲溶解提純到的絲
膠、絲素及膠原、甲殼素、纖維素、聚氨基酸、聚乳酸聚羥基乙酸共聚物、聚羥基乙酸、聚乳
酸，或者脫細(xì)胞真皮基質(zhì)；所述非降解型生物材料為聚酰胺、聚酯、聚苯乙烯、聚丙烯、聚丙
烯酸酯、聚氯乙烯、聚碳酸酯、聚四氟乙烯或硝酸纖維。 —種皮膚材料的制備方法，包括如下步驟 從健康皮膚中分離、消化組織，提取細(xì)胞； 制備轉(zhuǎn)基因細(xì)胞； 將光敏感基因轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中； 將含有轉(zhuǎn)基因的細(xì)胞接種于生物材料中，構(gòu)建含有細(xì)胞的組織工程化皮膚。
在優(yōu)選的實施例中，利用慢病毒作為載體轉(zhuǎn)染編碼光敏感離子通道蛋白基因到細(xì) 胞中。 在優(yōu)選的實施例中，所述慢病毒載體為人體免疫缺損病毒、乳多空病毒、腺病毒、 牛痘病毒、腺相關(guān)病毒、皰疹病毒和逆轉(zhuǎn)錄病毒中的一種。 上述皮膚材料移植到創(chuàng)面后，使光敏感離子通道蛋白的基因的多核苷酸序列連接 一個細(xì)胞特異啟動子，從而靶向性的特定細(xì)胞中表達(dá)，通過光照系統(tǒng)發(fā)出特定波長光的剌 激，調(diào)控特定細(xì)胞的活性，從而精確調(diào)控細(xì)胞的分化以及基因表達(dá)水平，使移植的皮膚材料 細(xì)胞和新生細(xì)胞與周圍的健康細(xì)胞之間生長同步，產(chǎn)生正常的皮膚附屬物，來促進(jìn)創(chuàng)面愈 合和提高愈合速度。
具體實施方式
研究發(fā)現(xiàn)，光敏感基因Channelrhodopsin-2(ChR2)對波長為470nm左右的藍(lán)光 敏感，表達(dá)ChR2的細(xì)胞在藍(lán)光的剌激下，細(xì)胞膜對Na+等陽離子的通透性增加，離子進(jìn)入細(xì) 胞，去極化，使興奮細(xì)胞；而Helorhodopsin(NphR)對波長為580nm左右的黃光敏感，表達(dá) NphR的細(xì)胞在黃光的照射下，細(xì)胞膜對C1—離子的通透性增加，導(dǎo)致細(xì)胞超極化，從而抑制 細(xì)胞活性?；诓《巨D(zhuǎn)染的蛋白表達(dá)系統(tǒng)，利用細(xì)胞類型特異性的啟動子，光敏感基因即可 在特定類型的細(xì)胞中表達(dá)。這樣利用藍(lán)光或黃光交替照射就可以在特定細(xì)胞亞群水平上在 生理的時間分辨率上控制細(xì)胞的活性，從而精確調(diào)控干細(xì)胞的分化以及基因表達(dá)水平。
—種皮膚材料，包括攜帶光敏感基因和目的基因的細(xì)胞和生物材料。借助來源于 微生物的光敏感基因來調(diào)控細(xì)胞的生長、分化和基因表達(dá)來促進(jìn)創(chuàng)面愈合和提高愈合速 度。 光敏感基因是編碼光敏感離子通道蛋白基因。編碼光敏感離子通道蛋白基因 可以是編碼興奮型通道蛋白基因(Channelrhodopsin-2， ChR2)、編碼抑制型通道蛋白 基因(Helorhodopsin， NpHR)、與ChR2具有相同功能的基因(如ChR2-310、 Chop2或者 Chop2-310)或者與NpHR具有相同功能的基因。 ChR2蛋白是一種視紫紅質(zhì)，起源于單細(xì)胞類綠藻萊茵衣藻 (ChlamydomonasReinhardtii)。視紫紅質(zhì)蛋白ChR2由一分子的視蛋白(Opsin)和一分子 稱為視黃醛(retinal)的生色基團所組成。ChR2對藍(lán)光(波長為472nm)敏感，藍(lán)光將使Na+等陽離子進(jìn)入細(xì)胞而興奮細(xì)胞。NpHR是一種嗜鹽菌紫質(zhì)(Halorhodopsins) 。 NphR對黃光(波長為593nm)敏感，
黃光將使cr等陰離子進(jìn)入細(xì)胞而抑制細(xì)胞。 編碼的ChR2/NpHR的多核苷酸序列可操作地連接一個細(xì)胞特異的啟動子，從而靶 向性的特定細(xì)胞中表達(dá)。 目的基因可以為人生長激素、表皮生長因子或成纖維細(xì)胞生長因子等。目的基因 可以轉(zhuǎn)染到與創(chuàng)面愈合相關(guān)的細(xì)胞中，使其大量表達(dá)相應(yīng)的有生物活性的蛋白，從而促進(jìn) 創(chuàng)面愈合的速度和提高創(chuàng)面愈合的質(zhì)量。 細(xì)胞可以是自體細(xì)胞、異體細(xì)胞或其混合物，如表皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、干細(xì)胞或 前體細(xì)胞等。 生物材料可以是可降解型生物材料，例如家蠶絲或柞蠶絲溶解提純到的絲膠、 絲素及膠原、甲殼素、纖維素、聚氨基酸、聚乳酸聚羥基乙酸共聚物(PLGA)、聚羥基乙酸 (PGA)、聚乳酸(PLA)，或者脫細(xì)胞真皮基質(zhì)；也可以是非降解型生物材料，如聚酰胺、聚酯、 聚苯乙烯、聚丙烯、聚丙烯酸酯、聚氯乙烯、聚碳酸酯、聚四氟乙烯、硝酸纖維等。
皮膚材料制備方法如下 Sl，從健康皮膚中分離、消化組織，提取細(xì)胞。健康皮膚可以取自自體或異體。另 外，還可以進(jìn)行細(xì)胞鑒定，并進(jìn)行細(xì)胞原代培養(yǎng)和傳代，例如進(jìn)行形態(tài)學(xué)、細(xì)胞表型和致癌 性等細(xì)胞鑒定。 S2，制備轉(zhuǎn)基因細(xì)胞。選擇能促進(jìn)創(chuàng)面愈合的目的基因，如人生長激素、表皮生長 因子、成纖維細(xì)胞生長因子等，轉(zhuǎn)染到創(chuàng)面愈合密切相關(guān)的細(xì)胞中，使其大量表達(dá)相應(yīng)的有 生物活性的蛋白，以促進(jìn)創(chuàng)面愈合的速度和提高創(chuàng)面愈合質(zhì)量。 S3，將光敏感基因轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中。本實施方式中，利用重組慢病毒載體等將攜帶編 碼光敏感離子通道蛋白基因轉(zhuǎn)染到目的細(xì)胞中。慢病毒載體克服了逆轉(zhuǎn)錄病毒只能感染分 裂期細(xì)胞的特點，可感染分裂期和非分裂細(xì)胞、目的基因整合至靶細(xì)胞基因組長期表達(dá)、感 染效率高。對慢病毒載體進(jìn)行了基因工程改造，使慢病毒的生活周期的復(fù)制能力失活。在病 毒DNA不整合至宿主細(xì)胞染色體的情況下實現(xiàn)慢病毒表達(dá)，由此減小了插入誘變的風(fēng)險。 經(jīng)過改建后的慢病毒載體可以容納約10kb左右的外源基因，可以兼容多個轉(zhuǎn)錄啟動子。慢 病毒載體可以是人體免疫缺損病毒、乳多空病毒、腺病毒、牛痘病毒、腺相關(guān)病毒、皰疹病毒 或者逆轉(zhuǎn)錄病毒等。 S4，將含有轉(zhuǎn)基因的細(xì)胞按一定細(xì)胞密度接種于生物材料中，構(gòu)建含有細(xì)胞的組 織工程化皮膚。將細(xì)胞接種于生物材料后，可以繼續(xù)培養(yǎng)，然后進(jìn)行皮膚剌激、遺傳毒性和 致敏試驗等一系列的檢測。 皮膚經(jīng)培養(yǎng)并檢驗合格后，可以進(jìn)行移植，將組織工程皮膚敷于創(chuàng)面上。移植前， 用75 %的酒精消毒，然后清除壞死的組織，將含有細(xì)胞液體涂于創(chuàng)面上，再立即將組織工程 皮膚敷于創(chuàng)面上。然后利用光照系統(tǒng)發(fā)光，調(diào)節(jié)光的強度和頻率，透過生物材料對移植細(xì)胞 進(jìn)行光剌激，在特定波長的光的剌激下，通過調(diào)控特定細(xì)胞的活性，從而調(diào)控移植細(xì)胞的生 長、分化和基因表達(dá)。光敏感基因可以只有興奮型通道蛋白基因，也可以只有抑制型通道蛋 白基因，還可以同時有興奮型通道蛋白基因和抑制型通道蛋白基因。如果同時有興奮型通 道蛋白基因和抑制型通道蛋白基因，則便于更好的控制細(xì)胞的生長、分化和基因表達(dá)。
光照系統(tǒng)由LED組成，可為單個或多個，光強度和頻率可調(diào)控。 上述皮膚材料可以應(yīng)用于臨床燒傷、潰瘍、創(chuàng)傷、畸形、術(shù)后缺損、疤痕等皮膚組織
修復(fù)和皮膚組織替代物等。采用上述皮膚材料移植到創(chuàng)面后，使光敏感離子通道蛋白的基
因ChR2/NpHR在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，通過特定波長光的剌激，調(diào)控特定細(xì)胞的活性，從而精確調(diào)控
細(xì)胞的分化以及基因表達(dá)水平，使移植的皮膚材料細(xì)胞和新生細(xì)胞與周圍的健康細(xì)胞之間
生長同步，產(chǎn)生正常的皮膚附屬物，來促進(jìn)創(chuàng)面愈合和提高愈合速度。 以上所述實施例僅表達(dá)了本發(fā)明的幾種實施方式，其描述較為具體和詳細(xì)，但并 不能因此而理解為對本發(fā)明專利范圍的限制。應(yīng)當(dāng)指出的是，對于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員 來說，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改進(jìn)，這些都屬于本發(fā)明的保 護(hù)范圍。因此，本發(fā)明專利的保護(hù)范圍應(yīng)以所附權(quán)利要求為準(zhǔn)。
權(quán)利要求
一種皮膚材料，其特征在于所述皮膚材料包括生物材料和攜帶光敏感基因和目的基因的細(xì)胞，所述細(xì)胞接種于所述生物材料中。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的皮膚材料，其特征在于所述細(xì)胞為自體細(xì)胞、異體細(xì)胞或自 體細(xì)胞和異體細(xì)胞的混合物。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的皮膚材料，其特征在于所述細(xì)胞為表皮細(xì)胞、成纖維細(xì) 胞、干細(xì)胞或前體細(xì)胞。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的皮膚材料，其特征在于所述光敏感基因包括興奮型通道蛋 白基因和/或抑制型通道蛋白基因。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的皮膚材料，其特征在于所述興奮型通道蛋白基因為ChR2、ChR2-310、 Chop2或者Chop2-310 ;所述抑制型通道蛋白基因為NpHR。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的皮膚材料，其特征在于所述目的基因為人生長激素、表皮生 長因子或成纖維細(xì)胞生長因子。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的皮膚材料，其特征在于所述生物材料為可降解型生物材料 或非降解型生物材料。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的皮膚材料，其特征在于所述可降解型生物材料為家蠶絲或柞蠶絲溶解提純到的絲膠、絲素及膠原、甲殼素、纖維素、聚氨基酸、聚乳酸聚羥基乙酸共聚物、聚羥基乙酸、聚乳酸，或者脫細(xì)胞真皮基質(zhì)；所述非降解型生物材料為聚酰胺、聚酯、聚 苯乙烯、聚丙烯、聚丙烯酸酯、聚氯乙烯、聚碳酸酯、聚四氟乙烯或硝酸纖維。
9. 一種皮膚材料的制備方法，其特征在于，包括如下步驟 從健康皮膚中分離、消化組織，提取細(xì)胞； 制備轉(zhuǎn)基因細(xì)胞； 將光敏感基因轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中；將含有轉(zhuǎn)基因的細(xì)胞接種于生物材料中，構(gòu)建含有細(xì)胞的組織工程化皮膚。
10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的皮膚材料的制備方法，其特征在于利用慢病毒作為載體轉(zhuǎn) 染編碼光敏感離子通道蛋白基因到細(xì)胞中。
11. 根據(jù)權(quán)利要求10所述的皮膚材料的制備方法，其特征在于所述慢病毒載體為人 體免疫缺損病毒、乳多空病毒、腺病毒、牛痘病毒、腺相關(guān)病毒、皰疹病毒和逆轉(zhuǎn)錄病毒中的 一種。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種皮膚材料，所述皮膚材料包括生物材料和攜帶光敏感基因和目的基因的細(xì)胞，所述細(xì)胞接種于所述生物材料中。上述皮膚材料應(yīng)用于制備臨床燒傷、潰瘍、創(chuàng)傷、畸形、術(shù)后缺損、疤痕等皮膚組織修復(fù)和皮膚組織替代物。采用上述皮膚材料移植后，通過光照使光感基因在特定細(xì)胞中表達(dá)，精確調(diào)控細(xì)胞的分化以及基因表達(dá)水平，使植入細(xì)胞和新生細(xì)胞及周邊健康細(xì)胞生長同步，產(chǎn)生正常皮膚附屬物，達(dá)到創(chuàng)面愈合質(zhì)量較高效果。此外，還提供了一種皮膚材料的制備方法。
文檔編號A61L27/38GK101693127SQ200910110740
公開日2010年4月14日 申請日期2009年9月30日 優(yōu)先權(quán)日2009年9月30日
發(fā)明者盧恬, 張奕, 王立平 申請人:深圳先進(jìn)技術(shù)研究院;