專利名稱：葡萄花色素苷組分及藥理活性研究的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及從葡萄或葡萄皮或葡萄皮和籽混合物中獲得的花色素苷組分，及該組分在降脂、抗氧化、調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細胞分泌功能、治療動脈粥樣硬化方面的藥理活性研究。
背景技術(shù)：
葡萄中的花色素苷是一類重要的天然色素，是賦予葡萄與葡萄酒紅色的主要物質(zhì)，對其質(zhì)量有著重要的影響。葡萄花色素苷分布于果皮、果肉、葡萄籽、芽鱗片等，主要分布于果皮。葡萄花色素苷主要包括9種成分:1、花翠素3-0-葡萄糖苷，2、花青素3-0-葡萄糖苷，3、甲花翠素3-0-葡萄糖苷，4、甲基花青素3-0-葡萄糖苷，5、二甲花翠素3-0-葡萄糖苷，6、甲基花青素3-0-￠-0-乙酰)葡萄糖苷，7、二甲花翠素3-0-￠-0-乙酰)葡萄糖苷，
8、甲基花青素3-0-￠-0-對香豆酰)葡萄糖苷，9、二甲花翠素3-0-￠-0-對香豆酰)葡萄糖苷。植物中蘊涵著豐富的花色素苷，花色素苷最突出的作用是使植物呈現(xiàn)五彩繽紛的顏色，同時花色素苷也是植 物中具有生理活性功能的成分?；ㄉ剀站哂泻軓姷目寡趸饔?，可以清除體內(nèi)的自由基；降低氧化酶的活性；可以降低高血脂的甘油脂水平；改善高甘油脂脂蛋白膽固醇含量；抗變異、抗腫瘤、抗過敏、保護胃粘膜等多種功能。自由基的連鎖氧化反應，可導致生物細胞膜有害物質(zhì)的形成和膜結(jié)構(gòu)的改性，如酶等蛋白質(zhì)、DNA等的改變，并引發(fā)各種疾病，如動脈粥樣硬化、糖尿病、腫瘤、心血管疾病和神經(jīng)性疾病等?；ㄉ剀帐乔宄杂苫芰ψ顝姷目寡趸瘎┖椭|(zhì)過氧化抑制劑，能夠防治多種因自由基引起的疾病，包括心臟病、癌癥及關(guān)節(jié)炎等病癥。葡萄原產(chǎn)于歐洲、西亞和北非一帶，伊朗是最早釀造葡萄酒的國家，歐洲最早開始種植葡萄并進行葡萄酒釀造的國家是希臘。葡萄品種很多，全世界約有上千種，總體上可以分為釀酒葡萄和食用葡萄兩大類。中國葡萄產(chǎn)于長江流域以北各地，主產(chǎn)于新疆、甘肅、寧夏、山西、河北、山東等地。中國釀酒葡萄主要有赤霞珠、黑比諾、梅爾諾、瑞引、品麗珠、西拉和馬貝克等，食用葡萄主要有巨峰、玫瑰香、紅提等。適合葡萄生長的地區(qū)和環(huán)境才有可能生產(chǎn)出理想的葡萄美酒。目前我國有4個原產(chǎn)地保護地區(qū)，分別是河北昌黎、沙城、山東煙臺和寧夏賀蘭山。而在國際上，各國也都有自己原產(chǎn)地保護區(qū)域。葡萄皮中的有效成分花色素苷在釀制葡萄酒過程中大部分轉(zhuǎn)移到了葡萄酒中，是葡萄酒中能檢測到的有效成分。釀制葡萄酒所產(chǎn)生的葡萄皮和籽的殘渣中卻含有許多沒有提取出去的有效成分，如葡萄籽中的原花青素和葡萄皮中的花色素苷。葡萄籽中的有效成分原花青素已經(jīng)有商品上市銷售，而葡萄皮中的花色素苷卻沒有見到上市銷售的商品。如將葡萄皮殘渣中的花色素苷提取出來加以利用，是對廢棄葡萄殘渣的再利用，是葡萄產(chǎn)業(yè)鏈的延伸，將產(chǎn)生巨大的經(jīng)濟效益和社會效益。從葡萄皮殘渣中提取的花色素苷有效組分水溶液又酸又澀，無法以液體形式食用。
本專利的創(chuàng)新之處及新穎性在于:經(jīng)過我們設(shè)計的提取分離精制工藝，可去掉花色素苷水溶液的酸澀味道，使花色素苷水溶液沒有什么怪味，可調(diào)制成任何味道而食用，可制成飲料、口服液、保健酒等；制定了花色素苷有效組分的質(zhì)量標準，使專利保護成為可能；進行了花色素苷有效組分的藥理活性研究，證明花色素苷有效組分能降脂、抗氧化、調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細胞分泌功能、治療動脈粥樣硬化。

發(fā)明內(nèi)容
赤霞珠的皮和籽混合物，經(jīng)過提取分離精制，獲得有效組分A2，A2可以是水溶液，也可以是固體。A2中主要有三種花色素苷，即:二甲花翠素3-0-葡萄糖苷，甲花翠素3-0-葡萄糖苷和甲基花青素3-0-葡萄糖苷，其中二甲花翠素3-0-葡萄糖苷的含量遠大于其他兩種花色素苷。歸一化法結(jié)果顯示，A2中二甲花翠素3-0-葡萄糖苷的含量大于66%，三種成分的含量總合大于85% (二甲花翠素3-0-葡萄糖苷，甲花翠素3-0-葡萄糖苷和甲基花青素3-0-葡萄糖苷)。外標法結(jié)果顯示，A2(固體)中二甲花翠素3-0-葡萄糖苷的含量為A2 = 25.29%。經(jīng)藥理學研究證實，A2具有降脂、抗氧化、調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細胞分泌功能、治療動脈粥樣硬化的藥理作用。為了研究有效組分中二 甲花翠素3-0-葡萄糖苷的含量變化是否影響有效組分的藥理活性，我們又制備了兩種有效組分Al和A3。A1、A3固體粉末中，二甲花翠素3_0_葡萄糖苷的含量分別為Al = 21.43%, A3 = 33.56%。歸一化法結(jié)果顯示，Al、A3中二甲花翠素3-0-葡萄糖苷的含量大于66%,三種成分的含量總合大于85% (二甲花翠素3-0-葡萄糖苷，甲花翠素3-0-葡萄糖苷和甲基花青素3-0-葡萄糖苷)。經(jīng)藥理學研究證實，三種有效組分Al = 21.43%,A2 = 25.29%, A3 = 33.56%在藥理活性上沒有差異。根據(jù)12批樣品HPLC分析，我們制定了葡萄花色素苷有效組分外標法含量標準，二甲花翠素3-0-葡萄糖苷的含量為20 35% ;歸一化法含量標準，二甲花翠素3-0-葡萄糖苷的含量為66 88%，三種成分的含量總合為85 100% (二甲花翠素3_0_葡萄糖苷，甲花翠素3-0-葡萄糖苷和甲基花青素3-0-葡萄糖苷)。中國釀酒葡萄主要有赤霞珠、黑比諾、梅爾諾、瑞引、品麗珠、西拉和馬貝克等，食用葡萄主要有巨峰、玫瑰香、紅提等。根據(jù)資料記載及我們的分析結(jié)果，花色素苷主要存在于葡萄皮中，不同品種葡萄中花色素苷成分種類近似，只是含量上有差異；我們關(guān)注的三種花色素苷成分，即:二甲花翠素3-0-葡萄糖苷，甲花翠素3-0-葡萄糖苷和甲基花青素3-0-葡萄糖苷在不同品種葡萄中普遍存在。雖然葡萄品種不同，但經(jīng)過我們的提取分離精制工藝，可以將其他成分最大限度地祛除，獲得有效組分，該有效組分的質(zhì)量符合我們制定的質(zhì)量標準。所以本專利適用于不同葡萄品種，提取有效組分時可以用葡萄、葡萄皮或葡萄皮和籽的混合物。實驗例I有效組分中花色素苷的HPLC分析1.1標準品和試劑二甲花翠素3-0-葡萄糖苷標準品(HPLC，純度98.23%，本公司實驗室自制)，甲醇(HPLC)，乙腈(HPLC)，超純水(0.22um)，甲酸(AR)。1.2 儀器高效液相色譜儀:島津Essentia LC-15C ;送液單元:LC_15C ;柱溫箱:CT0_15C ；檢測器:紫外檢測器SPD-15C ；自動進樣器:SIL-10AF。分析天平:sartorius,BT25S01.3色譜條件1.3.1 色譜柱:Zorbax SB C-18250X4.6mm 1.d.，保護柱:ZorbaxSBC-1812.5X4.6mm 1.d.。1.3.2測定波長535nm,流速lml/min,柱溫30°C,進樣體積20ul。1.3.3 流動相:7jC / 乙腈 / 甲酸(A = 80/10/7 ；B = 40/50/7)，1.3.4梯度:0min，0% B ；15min,30% B ；25min,50% B ；30min,0% B ；35min,0% B。1.4樣品處理和含量分析葡萄花色素苷有效組分12批，標準品和有效組分樣品用水溶解，用0.45um濾膜過
濾，直接進樣分析，重復三次。1.4.1歸一化法:主要測定二甲花翠素3-0-葡萄糖苷，甲花翠素3-0-葡萄糖苷和甲基花青素3-0-葡萄糖苷的相 對百分含量。歸一化時選擇最小峰面積為lOOOcounts。1.4.2外標法:用標準品作對照，測定二甲花翠素3-0-葡萄糖苷的含量。1.5分析結(jié)果1.5.1歸一化法結(jié)果:二甲花翠素3-0-葡萄糖苷的含量為66 88%，三種成分的含量總合為85 100% (二甲花翠素3-0-葡萄糖苷，甲花翠素3-0-葡萄糖苷和甲基花青素3-0-匍萄糖苷)。1.5.2外標法結(jié)果:二甲花翠素3-0-葡萄糖苷的含量為20 35%。實驗例2樣品Al、A2、A3對高脂血癥大鼠降脂抗氧化作用的影響試驗動物SD大鼠,雄性；體重:160土30g ；由中國食品藥品檢定研究院實驗動物資源中心提供，合格證號:SCXK (京)2009-0017。飼料:由北京科澳協(xié)力飼料有限公司提供，經(jīng)6tlCo照射滅菌。產(chǎn)品許可證號:SCXK-(京)2009-0012。試驗材料1.受試藥物:樣品Al溶液,干品中有效成分含量21.43樣品A2溶液,干品中有效成分含量25.29% ;樣品A3溶液，干品中有效成分含量33.56%。樣品溶液濃度:187.5g生藥/ml提取物。存儲于冰箱內(nèi)，臨用前搖勻。陽性對照:血脂康膠囊，北京北大維信生物科技有限公司(批號20110203)。2.試劑:總膽固醇(CHO)測試盒(批號20110620)，甘油三酯(TG)測試盒(批號20110431)，以上均由北京北化康泰臨床試劑有限公司提供；丙二醛(MDA)測定試劑盒(批號20110830)，超氧化物歧化酶(SOD)測定試劑盒(批號20110831)，均由南京建成生物工
程研究所提供。3.儀器:GF_D800型半自動生化分析儀，山東高密彩虹分析儀器有限公司。4.劑量:將樣品原藥液分別稀釋4倍，8倍，16倍，作為大、中、小劑量，相當于468、234、117g生藥/kg ;血脂康0.6g/kg。給藥容積lml/100g體重。試驗方法1.實驗分組:155只大鼠，首先分為空白對照組和高脂組，空白組12只，給予普通飼料喂養(yǎng)，其余143只為高脂組，給予高脂飼料(I %膽固醇，10%豬油，0.2%豬膽鹽，10%蛋黃粉，78.8%基礎(chǔ)飼料，由北京科澳協(xié)力有限公司提供)喂養(yǎng)15天，第15天動物眼眶靜脈叢采血lmL，測定血清總膽固醇(TC)，根據(jù)膽固醇水平，剔除未出現(xiàn)高脂血癥的高脂大鼠，其余隨機分組:模型組，陽性藥組，樣品Al大、中、小劑量組，樣品A2大、中、小劑量組，樣品A3大、中、小劑量組，每組12只，分組當天開始給藥，空白組和高脂模型組給予同體積的蒸懼水，除空白對照組外其余繼續(xù)給予高脂飼料喂養(yǎng)，連續(xù)給藥14天。2.取血:末次給藥后禁食12h，股動脈取血處死。3.指標測定:TC和TG的測定均為酶法，MDA的測定為TBA法，SOD的測定為黃嘌呤氧化酶法，均在半自動生化分析儀上進行檢測。4.數(shù)據(jù)分析:結(jié)果以均值土標準差形式表示，多組間比較采用方差分析(ANOVA)，統(tǒng)計學顯著性設(shè)定P < 0.05。試驗結(jié)果1.高脂飲食15天對各組大鼠總膽固醇(TC)水平的影響模型組大鼠給予高脂飲食15天后，與空白組比較，總膽固醇明顯升高(P<0.001)，說明高脂血癥大鼠模型建立成功。根據(jù)TC水平第二次隨機分組后，各組大鼠TC水平?jīng)]有明顯差異。見表I。表I聞脂飲食第15天大鼠血清總膽固醇(TC)水平(X±SD , n = 12)
權(quán)利要求
1.一種從葡萄或葡萄皮或葡萄皮和籽混合物中獲得的花色素苷組分，該組分的特征在于，外標法顯示，二甲花翠素3-0-葡萄糖苷的含量為20 35% ;歸一化法顯示，二甲花翠素3-0-葡萄糖苷的含量為66 88 %，二甲花翠素3-0-葡萄糖苷和甲花翠素3_0_葡萄糖苷和甲基花青素3-0-葡萄糖苷的含量總合為85 100% ;藥理學研究表明，該組分具有降月旨、抗氧化、調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細胞分泌功能、治療動脈粥樣硬化的藥理作用。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組分，其特征在于，該組分用于治療由于血脂增高導致的疾病。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組分，其特征在于，該組分用于治療由于自由基增多導致的疾病。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組分，其特征在于，該組分用于治療由于血管內(nèi)皮細胞分泌功能紊亂導致的疾病。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組分，其特征在于，該組分用于治療由于冠狀動脈粥樣硬化導致的疾病。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組分，其特征在于，該組分用于治療由于腦動脈粥樣硬化導致的疾病。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組分，其特征在于，該組分用于治療除了冠狀動脈和腦動脈之外其他臟器、器官及組織由于動脈粥樣硬化導致的疾病。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組分，其特征在于，將該組分制成碳酸飲料、功能性飲料、口服液、保健酒、水針劑、粉 針劑、片劑、膠囊、滴丸。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種從葡萄或葡萄皮或葡萄皮和籽混合物中獲得的花色素苷組分，制定了該組分的質(zhì)量標準，進行了藥理學研究；藥理學研究表明，該組分具有降脂、抗氧化、調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細胞分泌功能、治療動脈粥樣硬化的藥理作用。
文檔編號A61P3/06GK103222979SQ20131010892
公開日2013年7月31日 申請日期2013年4月1日 優(yōu)先權(quán)日2013年4月1日
發(fā)明者房寒冰, 魏峰 申請人:房寒冰