專利名稱：放射免疫偶聯(lián)物和其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及血液癌癥的放射免疫療法，該放射免疫療法是利用一種細(xì)胞毒性極高的經(jīng)過放射性標(biāo)記的單克隆抗體來進(jìn)行。
背景技術(shù)：
針對非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin lymphoma, NHL)已采用了一種利用經(jīng)過放射性標(biāo)記的抗體進(jìn)行的療法，并且該療法是一種目前已獲得批準(zhǔn)的方法。市場上有兩種產(chǎn)品，即，Zevalin 和Bexxar ，并且這兩種產(chǎn)品都以CD20抗原為目標(biāo)(Jacene等人，2007)。免疫治療劑利妥昔單抗(rituximab) (Rituxan /Mabthera )也以⑶20抗原為目標(biāo)。針對同一目標(biāo)的治療方法所存在的一個(gè)問題是，有可能在病程期間發(fā)生免疫表型漂移(immunophenotypic drift) (Ngo等人，2009),當(dāng)在利妥昔單抗療法中隨時(shí)間 重復(fù)CD20療法時(shí)，或者如果在長期的利妥昔單抗療法后給予基于CD20的放射免疫療法(radio immunotherapy, RIT),該免疫表型漂移會(huì)引起0)20療法的作用減弱。很多接受了針對CD20的療法的患者最終將會(huì)出現(xiàn)復(fù)發(fā)(Buchegger等人，2006 ；Gordon等人，2004)。因此，對于一種在NHL患者體內(nèi)以除⑶20外的另一種抗原為目標(biāo)的放射免疫療法(RIT)存在。在RIT的早期開發(fā)過程中，對⑶37和⑶20兩種抗原作為目標(biāo)進(jìn)行了評估(Press等人，2001)。由此得出結(jié)論，以⑶20為目標(biāo)的RIT更為適合，并且因此放棄了針對⑶37的RIT的開發(fā)。因而，在所屬領(lǐng)域中已知多種單克隆抗體適用于針對淋巴瘤的RIT中，但以CD20為目標(biāo)的放射免疫偶聯(lián)物(radioimmunoconjugate，RIC)優(yōu)于以CD37為目標(biāo)的RIC(Press 等人,2001)。近年來，0)37已引起了一些新的關(guān)注(Heider等人，2009 ;Grosmaire, 2007),它主要是作為使用嵌合或人源化抗體構(gòu)建體的免疫療法的目標(biāo)。這些研究提出，不要使用常規(guī)的鼠類IgG單克隆抗體，因?yàn)檫@些鼠類抗體會(huì)誘導(dǎo)患者體內(nèi)產(chǎn)生人類抗小鼠的抗體(HAMA)，這可能會(huì)引起不適，并且降低免疫療法的功效。在RIT中，常規(guī)的鼠類單克隆抗體仍被認(rèn)為是值得關(guān)注的，因?yàn)樗玫鞍踪|(zhì)劑量總體而言較低，而且無需如同免疫療法同樣程度地重復(fù)進(jìn)行治療。鼠類IgG的清除總體而言也比鼠類IgG的人源化或嵌合型式略快，這一點(diǎn)至少在某些背景下從RIT的全身輻射暴露來講可能更恰當(dāng)。應(yīng)注意的是，Bexxar和Zevalin兩者都是基于鼠類抗體。本發(fā)明提供抗CD37的鼠類抗體HHl作為放射性同位素的載體。產(chǎn)生該鼠類抗CD37抗體HHl的首個(gè)雜交瘤克隆體是在1980年代開發(fā)出來的(Smeland等人，1985)，并且數(shù)年來，該HHl抗體一直在進(jìn)行銷售，在體外用于免疫組織化學(xué)技術(shù)中。對于HHl在放射免疫療法中的生物分布以及細(xì)胞的細(xì)胞毒性，先前未作評估。因此，當(dāng)前的研究是著手對HHl在放射免疫療法中的適用性進(jìn)行評估。先前利用抗CD37的RIC的臨床和臨床前研究使用了氯胺T/Iodogen法用131I直接對多個(gè)酪氨酸殘基進(jìn)行放射性標(biāo)記，相比之下，HHl是使用金屬放射性核素代替鹵素，通過螯合劑進(jìn)行放射性標(biāo)記。使用一種已通過螯合劑-連接子進(jìn)行標(biāo)記的金屬放射性核素可為有利的，因?yàn)闃?biāo)記有131I的抗體的使用會(huì)使得甲狀腺暴露于由RIC釋放的不同量的碘。在先前一項(xiàng)旨在評估HHl是否適于制備放射免疫偶聯(lián)物的研究中，曾將CHX-A-DTPA與HHl偶聯(lián)，并且用2°5，2°6Bi標(biāo)記該偶聯(lián)物，來達(dá)到建立體外模型的目的(Henriksen 等人,1997)。對鉍與HHl或與抗生蛋白鏈菌素(streptavidin)的偶聯(lián)物在細(xì)胞系Raji中的攝取情況進(jìn)行了比較。在鉍與抗生蛋白鏈菌素的偶聯(lián)物的情形中，細(xì)胞曾用生物素化的HHl預(yù)先飽和。已發(fā)現(xiàn)，當(dāng)用212Bi或213Bi進(jìn)行標(biāo)記時(shí)，確保功能性RIC所需的螯合劑數(shù)目是一個(gè)限制性因素。因此，提出了使用生物素化的HHl來代替基于HHl的RIC。一旦結(jié)合于細(xì)胞，該生物素化的HHl因而就可以作為經(jīng)過放射性標(biāo)記的抗生蛋白鏈菌素的目標(biāo)。因此，該項(xiàng)研究提出，由于用發(fā)射a -粒子的放射性核素標(biāo)記的HHl在認(rèn)為HHl可耐受的螯合劑濃度下的比活性不足以保持足夠的結(jié)合能力，故該HHl不太有用。 該論文還指出，與a-發(fā)射體相比較，￠-發(fā)射體將更不適合構(gòu)建功能性RIC(Henriksen等人，1997),因?yàn)槠渥髡咧赋?，由于交叉放?cross-fire)對于獲得足夠的效應(yīng)至關(guān)重要，故利用3-發(fā)射體的靶向性放射療法彌散性疾病較差。因此，上文列舉的研究提出，在放射免疫療法中不要使用直接螯合的HH1，而且在基于P -發(fā)射體的RIC中也不要使用HHl。發(fā)明概述本發(fā)明涉及一種結(jié)合人類⑶37的放射免疫偶聯(lián)物，包含鼠類單克隆抗體HH1、一個(gè)連接子以及一種放射性核素，該放射性核素選自由以下各項(xiàng)組成的組，即211At、213Bi、212Bi、212Pb、225Ac、227Th、9°Y、186Re、188Re、199Au, 194Ir, 166Ho, 159Gd, 153Sm, 149Pm, 142Pr, 111Ag, 109Pd,77As、67Cu、47Sc 以及 177Lu。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，該連接子是一種螯合性連接子，并且該放射性核素是 177Lu。本發(fā)明的一個(gè)方面涉及一種藥物組合物，包含一種本發(fā)明的放射免疫偶聯(lián)物和一種藥學(xué)上可接受的載體。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的藥物組合物包含一種或多種另外的抗體或放射免疫偶聯(lián)物。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，一種或多種另外的抗體或放射免疫偶聯(lián)物以CD20為目標(biāo)。本發(fā)明的又一個(gè)實(shí)施方案涉及一種本發(fā)明的藥物組合物，用于對表達(dá)⑶37抗原的B細(xì)胞惡性細(xì)胞進(jìn)行治療。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，該藥物組合物是用于治療非霍奇金淋巴瘤和慢性淋巴細(xì)胞白血病。本發(fā)明的一個(gè)方面涉及本發(fā)明的放射免疫偶聯(lián)物的用途，用于治療B細(xì)胞惡性腫瘤。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案涉及本發(fā)明的放射免疫偶聯(lián)物的使用，該放射免疫偶聯(lián)物是組合或連同另一種療法一起給予的。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，該療法選自預(yù)治療、化學(xué)療法、單克隆抗體療法、手術(shù)、放射療法和/或光動(dòng)力療法。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，該療法包含先使用抗CD20和/或抗CD37的單克隆抗體進(jìn)行預(yù)治療，然后用本發(fā)明的放射免疫偶聯(lián)物進(jìn)行治療。本發(fā)明的一個(gè)方面涉及一種用于對選自非霍奇金淋巴瘤和慢性淋巴細(xì)胞白血病的一種B細(xì)胞惡性腫瘤進(jìn)行治療的方法，包括給予有效量的一種本發(fā)明的藥物組合物。本發(fā)明另一方面涉及一種用于制備本發(fā)明的放射免疫偶聯(lián)物的試劑盒，包含兩個(gè)或更多個(gè)小瓶，其中一個(gè)小瓶含有一種偶聯(lián)物，該偶聯(lián)物包含與一種鼠類單克隆抗體HHl連接的一種螯合劑；并且一個(gè)第二小瓶含有一種放射性核素。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案涉及一種本發(fā)明的試劑盒，其中這些小瓶中一個(gè)或數(shù)個(gè)的 內(nèi)含物是經(jīng)過凍干的或呈一種溶液的形式。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，該放射免疫偶聯(lián)物是通過對該兩個(gè)小瓶的內(nèi)含物進(jìn)行混合而產(chǎn)生。附圖簡要說明圖I在Raji、Rael以及Daudi 細(xì)胞與 111In-HHU111In-利妥昔單抗、125I-HHl 以及 125I-利妥昔單抗一起培養(yǎng)時(shí)在洗滌后立即(A)和96小時(shí)(B)得到的結(jié)合細(xì)胞的抗體。圖2在與mLu-HHl或mLu-利妥昔單抗一起培養(yǎng)2小時(shí)(A)和18小時(shí)(B)后結(jié)合于Daudi細(xì)胞的活性。阻斷的細(xì)胞是用IOOy g/ml未經(jīng)過標(biāo)記的抗體阻斷的。圖3在洗滌前與mLu-HHl (A)或mLu-利妥昔單抗(B) —起培養(yǎng)2小時(shí)的Daudi細(xì)胞的生長情況。圖4在洗滌前與mLu-HHl (A)或mLu-利妥昔單抗(B) —起培養(yǎng)18小時(shí)的Daudi細(xì)胞的生長情況。圖5在帶有Daudi異種移植物的小鼠中通過螯合劑標(biāo)記111In的HHl的生物分布。圖6未經(jīng)過標(biāo)記的Daudi細(xì)胞、僅用二次抗體標(biāo)記的Daudi細(xì)胞、或者用HH1、0N. 108、IP0. 24或6D263標(biāo)記的Daudi細(xì)胞的FITC柱形圖。圖7在帶有Daudi腫瘤的雌性裸小鼠中mLu-的生物分布。圖8對小鼠靜脈內(nèi)(iv)注射Daudi細(xì)胞的療法。利用50和100MBq/kg mLu_HHl、冷的HH1、冷的利妥昔單抗以及NaCl治療的小鼠的存活率。發(fā)明詳細(xì)說明本發(fā)明涉及抗體HHl在放射免疫療法中的使用。一種金屬放射性核素、連接子與抗⑶37的單克隆抗體的組合出人意料地顯示，經(jīng)過放射性標(biāo)記的HHl在一個(gè)異種移植物/裸小鼠模型中具有一種相關(guān)的生物分布和腫瘤攝取。這個(gè)重要信息表明了在放射免疫療法中的適用性。放射免疫偶聯(lián)物本發(fā)明出人意料地顯示，放射免疫偶聯(lián)物mLu-HHl對彌散性腫瘤細(xì)胞展現(xiàn)出一種顯著的細(xì)胞毒性，并且在給定劑量下，mLu-HHl針對這些腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒性高于177Lu-利妥昔單抗。這一發(fā)現(xiàn)是出乎意料的，因?yàn)槊恳患?xì)胞結(jié)合更多的放射物，并且結(jié)合的放射性核素的保留度類似于或優(yōu)于mLu-利妥昔單抗。 該傳授內(nèi)容與本領(lǐng)域中的常識相反，本領(lǐng)域的常識是對于放射免疫療法而言，抗⑶20抗體優(yōu)于抗⑶37抗體。此外，本研究與先前觀念的不同之處在于，對于￠-發(fā)射體，無法在彌散性細(xì)胞中獲得的交叉放射對于獲得足夠的作用將至關(guān)重要(Henriksen等人，1997)。出現(xiàn)所觀察的效應(yīng)的原因尚不清楚。由利用不同劑量的未經(jīng)過標(biāo)記的HHl和利妥昔單抗進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)得到的數(shù)據(jù)在所用生長檢驗(yàn)中并未指示由這些未經(jīng)過標(biāo)記的抗體所產(chǎn)生的任何作用。一個(gè)可能的解釋可以是，CD37與CD20相比較，具有極低抗原密度的細(xì)胞更少，即使平均起來，CD20在所用細(xì)胞上具有更為強(qiáng)烈的表達(dá)。保留度數(shù)據(jù)因⑶37的內(nèi)化而無法呈現(xiàn)更好的保留度，這將是另一個(gè)可能的解釋，因?yàn)閾?jù)報(bào)導(dǎo)，關(guān)于⑶37抗原存在一些內(nèi)化現(xiàn)象(Press等人，2001)。因此，本發(fā)明涉及一種結(jié)合人類CD37的放射免疫偶聯(lián)物，包含鼠類單克隆抗體HH1、一個(gè)連接子以及一種放射性核素，該放射性核素選自由以下各項(xiàng)組成的組，即211At、213Bi、212Bi、212Pb、225Ac、227Th、9°Y、186Re、188Re, 199Au, 194Ir, 166Ho, 159Gd, 153Sm, 149Pm, 142Pr, 111Ag,109PdJ7As, 67Ciu47Sc 以及 177Lu。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，該連接子是一種螯合性連接子。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，該放射性核素是mLu。在又一個(gè)實(shí)施方案中，該放射性核素是另一種￠-發(fā)射體或是一種Ct-發(fā)射體。根據(jù)體外數(shù)據(jù)，本發(fā)明提出，經(jīng)過放射性標(biāo)記的HHl與⑶37抗原的結(jié)合比經(jīng)過放射性標(biāo)記的利妥昔單抗與CD20抗原的結(jié)合更有效，即，該經(jīng)過放射性標(biāo)記的HHl用更少的循環(huán)抗體就達(dá)到與該抗原的最大結(jié)合(表2，圖2)。它達(dá)到最大結(jié)合所需的時(shí)間也更少(圖2)。這些也將是重要的體內(nèi)特征，因?yàn)檫@意味著腫瘤細(xì)胞甚至在較低的循環(huán)抗體濃度下也能截留RIC，而循環(huán)抗體濃度較低的情形可能在較不易達(dá)到的實(shí)體腫瘤區(qū)域以及位于正常組織的遠(yuǎn)端區(qū)域中的多個(gè)單一腫瘤細(xì)胞和微轉(zhuǎn)移中出現(xiàn)。這一點(diǎn)與先前數(shù)據(jù)明顯不同，先前的數(shù)據(jù)曾指出，利用另一種抗CD37抗體使抗原飽和并且獲得有利的生物分布所需的抗體濃度高于HHKBernstein等人，1990)，也高于一種抗CD20抗體(Press等人,1993)。此外，本發(fā)明還顯示，與一組三種不同的抗⑶37抗體相比較，HHl具有一些不同的抗原結(jié)合特性，不過所有這些抗體實(shí)質(zhì)上都結(jié)合于同一表位。阻斷實(shí)驗(yàn)(S卩，使用以未經(jīng)過標(biāo)記的抗體預(yù)先飽和的細(xì)胞進(jìn)行的實(shí)驗(yàn))顯示，HHl將阻止活細(xì)胞上的⑶37結(jié)合于經(jīng)過放射性標(biāo)記的HHl，實(shí)質(zhì)上優(yōu)于其他三種抗⑶37抗體。在對多種經(jīng)過放射性標(biāo)記的抗體進(jìn)行比較的一項(xiàng)細(xì)胞檢驗(yàn)中，HHl顯示的免疫活性分?jǐn)?shù)比其他三種抗體高得多。免疫活性分?jǐn)?shù)是指在存在無限制的過量抗原的情況下能結(jié)合抗原的抗體的分?jǐn)?shù)。不同的抗體在經(jīng)歷標(biāo)記程序后，可以具有不同的保持免疫活性的能力。實(shí)例6實(shí)驗(yàn)IV的表5中的結(jié)果顯示，HHl所保持的免疫活性高于三種可商購抗體的免疫活性。另一方面，多項(xiàng)免疫組織化學(xué)分析顯示，這三種抗體使由經(jīng)過石蠟包埋的固定的腫瘤樣品得到的組織切片染色，而HHl未能如此?？贵w抗原相互作用的差異無法通過流式細(xì)胞術(shù)來檢測。HHl與這三種其他抗⑶37抗體的流式細(xì)胞術(shù)柱形圖是相似的(圖6)?？傮w來說，這些數(shù)據(jù)顯示，HHl具有一種重要的個(gè)體性抗原相互作用，這一相互作用在幾個(gè)方面上無法由利用其他抗CD37抗體的研究預(yù)測出來。 這里描述的具有強(qiáng)細(xì)胞毒性特性的新穎抗CD37放射免疫偶聯(lián)物由鼠類單克隆抗體HHl、一種螯合性連接子以及P -發(fā)射體mLu組成。該放射性核素可以通過以下步驟附接到抗體首先使一種雙官能螯合劑，例如p-SCN-bn-DOTA (Macrocyclics, Tx, USA),與該抗體反應(yīng),隨后進(jìn)行純化以除去未偶聯(lián)的螯合劑，接著使螯合劑抗體偶聯(lián)物與該放射性核素反應(yīng)，隨后進(jìn)行純化以除去任何未偶聯(lián)的放射性核素。作為替代方案，可以先將螯合劑與放射性核素組合，隨后與抗體偶聯(lián)。螯合性連接子(例如，如p-SCN-bn-DOTA)可用于使其他金屬放射性核素按與關(guān)于177Lu所述類似的方式與HHl偶聯(lián)。具有足夠的絡(luò)合能力以及允許與一種蛋白質(zhì)或肽直接或間接偶聯(lián)的一個(gè)官能團(tuán)的任何類型的連接子都可以使用。這些連接子的實(shí)例描述于文獻(xiàn)中(例如，Brechbiel, 2008 ；Liu, 2008)。一些有用的實(shí)例是雙官能的環(huán)狀螯合劑，如p-SCN-bn-DOTA、DOTA-NHS-酯；雙官能的線性螯合劑，如p-SCN-Bn-DTPA 和 CHX-A" -DTPA。本發(fā)明中的多種放射性核素將優(yōu)選通過使用雙官能螯合劑與一個(gè)目標(biāo)分子偶聯(lián)。這些雙官能螯合劑可以是環(huán)狀、線性或分支狀螯合劑。特別應(yīng)提到的是聚氨基聚酸螯合劑，這些螯合劑包含一個(gè)線性、環(huán)狀或分支狀聚氮雜烷烴主鏈，其中有多個(gè)酸性(例如，羧基烷基)基團(tuán)附接在該主鏈氮上。適合的螯合劑的實(shí)例包括DOTA衍生物，如對異硫氰酸基苯甲基-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-I，4，7，10-四乙酸(p-SCN-Bz-DOTA)和DTPA衍生物，如對異硫氰酸基苯甲基-二亞乙基三胺五乙酸(p-SCN-Bz-DTPA)，前者是環(huán)狀螯合劑，后者是線性螯合劑。絡(luò)合部分的金屬化可以在該絡(luò)合部分與目標(biāo)部分偶聯(lián)之前或之后進(jìn)行。如果螯合劑是在進(jìn)行放射性標(biāo)記之前與抗體偶聯(lián)，則進(jìn)行放射性標(biāo)記的程序在所用時(shí)間等方面一般將更適宜。使用與抗體附接的螯合劑來制備經(jīng)過放射性標(biāo)記的偶聯(lián)物的原理在(例如)Liu, 2008中有更為全面的描述。因此，可以使用HHl來制備多種放射免疫偶聯(lián)物，這些放射免疫偶聯(lián)物具有不同的輻射特性和有效半衰期。舉例來說，可以制備由鼠類單克隆抗體HH1、一個(gè)螯合性連接子以及一種發(fā)射3粒子或發(fā)射a粒子的放射性核素(包括但不限于177Lu、211At、213Bi、212Bi、212Pb、225Ac、227Th、90Y^186Re,188Re,199Au,194Ir,166Ho, 159Gd、153Sm、149Pm、142Pr、niAg、1(l9Pd、77AS、67Cu、47SC)組成的抗CD37放射免疫偶聯(lián)物，并且使用這種放射免疫偶聯(lián)物來制備多種藥物制劑，并用于多種治療應(yīng)用中。藥物組合物基于HHl的一種放射免疫治療產(chǎn)品典型地將會(huì)以一種藥物組合物的形式提供，該藥物組合物是由根據(jù)以上描述的一種放射性核素通過一種螯合劑與溶解于一種緩沖溶液中的鼠類單克隆抗體HHl連接而組成，這在很大程度上保持了放射免疫偶聯(lián)物的化學(xué)完整性，并且將其輸注到患者體內(nèi)在生理學(xué)上是可接受的。
因此，本發(fā)明的一個(gè)方面涉及一種藥物組合物，包含一種本發(fā)明的放射免疫偶聯(lián)物以及一種藥學(xué)上可接受的載體和/或賦形劑。可接受的藥物載體包括但不限于無毒緩沖劑、填充劑、等滲溶液等。更具體地說，該藥物載體可以是(但不限于)生理鹽水(0. 9%)、二分之一生理鹽水(half-normalsaline)、林格氏乳酸鹽(Ringer，s lactate)、5%右旋糖、3. 3%右旋糖/0. 3%鹽水。生理學(xué)上可接受的載體可以含有一種放射分解性穩(wěn)定劑，例如抗壞血酸，這種穩(wěn)定劑能在儲(chǔ)存和運(yùn)輸期間保持放射性藥物的完整性。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案包含本發(fā)明的藥物組合物和一種或多種另外的抗體或放射免疫偶聯(lián)物。抗體包括但不限于利妥昔單抗、依帕珠單抗(Epratuzumab)、L19、F8、F16、加利昔單抗(Galiximab)、托利珠單抗(Toralizumab)、阿來組單抗(Alemtuzumab)、奧法木單抗(Ofatumumab)、維妥珠單抗(Veltuzumab)、阿托珠單抗(Afutuzumab)、托西莫單抗(Tositumomab)、利圖斯(Reditux)以及替伊莫單抗(Ibritumomab)。放射免疫偶聯(lián)物包括但不限于Zevalin和Bexxar。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，一種或多種另外的抗體或放射免疫偶聯(lián)物以CD20為目標(biāo)。抗體包括但不限于利妥昔單抗、維妥珠單抗、奧法木單抗、阿托珠單抗、托西莫單抗、利圖斯以及替伊莫單抗。放射免疫偶聯(lián)物包括但不限于Zevalin和Bexxar。本發(fā)明的又一個(gè)實(shí)施方案涉及一種本發(fā)明的藥物組合物，用于對表達(dá)⑶37抗原的B細(xì)胞惡性細(xì)胞進(jìn)行治療。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，該藥物組合物是用于治療非霍奇金淋巴瘤和慢性淋巴細(xì)胞白血病的。序列一致性與一般定義一樣，“一致性”在這里定義為分別在核苷酸或氨基酸水平上的多個(gè)基因或多種蛋白質(zhì)之間的序列一致性。因此，在本文中，“序列一致性”是在氨基酸水平上多種蛋白質(zhì)之間一致性的一種量度，以及在核苷酸水平上多個(gè)核酸之間的一致性的一種量度。蛋白質(zhì)序列一致性可以通過在比對多個(gè)序列時(shí)比較每一序列中某一指定位置的氨基酸序列來確定。類似地，核酸序列一致性可以通過在比對多個(gè)序列時(shí)比較每一序列中某一指定位置的核苷酸序列來測定。為了測定兩個(gè)核酸序列或兩個(gè)氨基酸的一致性百分比，出于進(jìn)行最佳比較的目的，對這些序列進(jìn)行比對(例如，可以在第一個(gè)氨基酸序列或核酸序列中引入多個(gè)空隙，以便與第二個(gè)氨基酸或核酸序列達(dá)到最佳比對)。接著對多個(gè)相應(yīng)氨基酸位置或核苷酸位置的氨基酸殘基或核苷酸進(jìn)行比較。當(dāng)占據(jù)第一個(gè)序列中某一位置的氨基酸殘基或核苷酸與第二個(gè)序列中相應(yīng)位置的氨基酸殘基或核苷酸相同時(shí)，則這些分子在該位置是一致的。兩個(gè)序列之間的一致性百分比會(huì)隨這些序列所共有的一致位置的數(shù)目而變化(即，一致性％= —致位置的數(shù)目/位置(例如重疊的位置)的總數(shù)X 100)。在一個(gè)實(shí)施方案中，這兩個(gè)序列具有相同長度?？梢允謩?dòng)比對這些序列，并且計(jì)算出一致核酸或氨基酸的數(shù)目。作為替代方案，可以使用一種數(shù)學(xué)算法比對兩個(gè)序列，以測定一致性百分比。此種算法被并入NBLAST和XBLAST程序中。BLAST核苷酸檢索可以用NBLAST程序進(jìn)行，總分=100，字長=12，由此獲得 與本發(fā)明的核酸分子同源的多個(gè)核苷酸序列。BLAST蛋白質(zhì)檢索可以用XBLAST程序進(jìn)行，總分=50，字長=3，由此獲得與本發(fā)明的蛋白質(zhì)分子同源的多個(gè)氨基酸序列。為了進(jìn)行帶空隙的比對以達(dá)到比較的目的，可以利用Gapped BLAST。作為替代方案，可以使用PSI-Blast來進(jìn)行一種迭代檢索法，檢測多個(gè)分子之間的遠(yuǎn)緣關(guān)系。當(dāng)利用NBLAST、XBLAST以及Gapped BLAST程序時(shí)，可以使用相應(yīng)程序的默認(rèn)參數(shù)。參見http://www. ncbi. nlm. nih. gov。作為替代方案,可以在對多個(gè)序列進(jìn)行比對之后,例如通過BLAST程序在EMBL數(shù)據(jù)庫中來計(jì)算序列一致性(www. ncbi. nlm. gov/cgi-bin/BLAST) 總體來說，可以使用有關(guān)(例如)“計(jì)分矩陣”和“空隙罰分”的默認(rèn)設(shè)置來進(jìn)行比對。在本發(fā)明的上下文中，BLASTN和PSI BLAST的默認(rèn)設(shè)置可為有益的。兩個(gè)序列之間的一致性百分比可以在允許有空隙或不允許有空隙的情況下，使用與上文所述類似的技術(shù)測定。在計(jì)算一致性百分比時(shí)，只對精確匹配計(jì)數(shù)。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案涉及一種分離的核酸，包含與HHl抗體的VH序列(SEQ IDNO: I)和/或VL序列(SEQ ID N0:3)共有80%序列一致性的一個(gè)序列。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案涉及一種分離的核酸，包含一個(gè)序列，該序列帶有HHl抗體的 VH 序列(SEQ ID NO: I)和 / 或 VL 序列(SEQ ID N0:3)。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，該分離的核酸包含與HHl抗體的VH序列(SEQ IDNO: I)和/或VL序列(SEQ ID NO: 3)共有至少90%序列一致性，如90% —致性、91%—致性、92% —致性、93% —致性、94% —致性、95% —致性、96% —致性、97% —致性、98% —致性或99% 一致性的一個(gè)序列。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案涉及一種抗體，包含與HHl抗體的VH序列(SEQ IDNO: 2)和/或VL序列(SEQ ID NO:4)共有80%序列一致性的一個(gè)多肽序列。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案涉及一種抗體，包含一個(gè)多肽序列，該多肽序列帶有HHl抗體的 VH 序列(SEQ ID NO:2)和 / 或 VL 序列(SEQ ID N0:4)。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，該抗體包含與HHl抗體的VH序列(SEQ ID N0:2)和/或VL序列(SEQ ID NO:4)共有至少90%序列一致性，如90% —致性、91% —致性、92% —致性、93% —致性、94% —致性、95% —致性、96% —致性、97% —致性、98% —致性或99% —致性的一個(gè)序列。
遺傳變異遺傳變異是由基因中核苷酸的堿基次序發(fā)生變化而引起的。這種變化使這些基因發(fā)生突變，隨后使這些基因所編碼的蛋白質(zhì)發(fā)生突變。這些突變可以是有義突變或錯(cuò)義突變，或者是取代。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案涉及HHl單克隆抗體的VH鏈(SEQ ID NO: I)和/或VL鏈(SEQ ID N0:3)的分離的核酸序列，該分離的核酸序列包含至少50個(gè)，如20個(gè)，如10個(gè)，如5個(gè)，如4個(gè)，如3個(gè)，如2個(gè)，如I個(gè)有義突變。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案涉及HHl單克隆抗體的VH鏈(SEQ ID N0:1)和/或VL鏈(SEQ ID NO:3)的分離的核酸序列，該分離的核酸序列包含0到50個(gè)，如I到50個(gè)，如0到20個(gè)，如I到20個(gè)，如0到10個(gè)，如I到10個(gè)，如0到5個(gè)，如I到5個(gè)，如3個(gè)，如I
·個(gè)有義突變。錯(cuò)義突變(一類非同義突變)是一種點(diǎn)突變，在這種突變中，單一核苷酸發(fā)生改變，產(chǎn)生一種編碼不同氨基酸的密碼子(將一種氨基酸變?yōu)橐粋€(gè)終止密碼子的突變被認(rèn)為是無義突變，而不是錯(cuò)義突變)。錯(cuò)義突變可以使所得到的蛋白質(zhì)沒有功能性。然而，并非所有的錯(cuò)義突變都導(dǎo)致可觀的蛋白質(zhì)變化。一個(gè)氨基酸可以用化學(xué)特性極為相似的一個(gè)氨基酸替代，在這種情況下，蛋白質(zhì)仍能夠正常起作用；這被稱為中性、“安靜(quiet)”或保守突變。作為替代方案，可以在蛋白質(zhì)的一個(gè)區(qū)域中進(jìn)行氨基酸取代，這種取代不會(huì)明顯影響蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)或功能。當(dāng)一個(gè)氨基酸可能由多于一個(gè)密碼子編碼(所謂的“簡并編碼，，)時(shí)，密碼子中的突變可能不會(huì)在翻譯中產(chǎn)生任何變化；這種突變將是一種同義突變(一種沉默突變形式)，而不是一種錯(cuò)義突變。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案涉及一種抗體，包含HHl單克隆抗體的VH鏈(SEQ IDNO: I)和/或VL鏈(SEQ ID NO: 3)的一個(gè)多肽序列，該多肽序列包含至少50個(gè)，如20個(gè)、如10個(gè)、如5個(gè)、如4個(gè)、如3個(gè)、如2個(gè)、如I個(gè)錯(cuò)義突變。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案涉及一種抗體，包含HHl單克隆抗體的VH鏈(SEQ IDNO: I)和/或VL鏈(SEQ ID NO:3)的一個(gè)多肽序列，該多肽序列包含0到50個(gè)，如I到50個(gè)，如0到20個(gè)，如I到20個(gè)，如0到10個(gè)，如I到10個(gè)，如0到5個(gè)，如I到5個(gè)，如3個(gè)，如I個(gè)錯(cuò)義突變。保守取代是用具有大體上類似特性的一個(gè)氨基酸取代另一個(gè)氨基酸，以致整體功能性很可能不受明顯影響的一種取代。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，是錯(cuò)義突變、保守突變或取代。本發(fā)明的又一個(gè)實(shí)施方案涉及一種分離的核酸序列或一種多肽序列，與HHl的可變重鏈(SEQ ID N0:2)和/或可變輕鏈(SEQ ID N0:4)序列具有80%序列一致性，其中序列變異是保守取代。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，序列一致性是80% —致性，如90% —致性、91%—致性、92% —致性、93% —致性、94% —致性、95% —致性、96% —致性、97% —致性、98% —致性或99% 一致性，并且序列變異是保守取代。為了對放射性標(biāo)記的步驟進(jìn)行改進(jìn)，宜將額外的賴氨酸引入(例如)HH1的Fe部分中。此舉可以減小將結(jié)合賴氨酸的螯合劑附接到該抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)中的幾率，由此降低在進(jìn)行放射性標(biāo)記期間損害免疫活性的風(fēng)險(xiǎn)。用于將賴氨酸引入(例如)HHl的Fe部分中的方法在本領(lǐng)域中是已知的，例如由Hemminki 等人,1995 獲知。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案涉及本發(fā)明的放射免疫偶聯(lián)物，該放射免疫偶聯(lián)物已在HHl 的 Fe 部分中用 10 個(gè) Lys(如 8 個(gè) Lys^n 6 個(gè) Lys^n 5 個(gè) Lys^n 4 個(gè) Lys^n 3 個(gè) Lys、如2個(gè)Lys^n I個(gè)Lys)進(jìn)行了修飾。治療
根據(jù)本發(fā)明的藥物溶液的治療應(yīng)用可以是對表達(dá)CD37抗原的惡性細(xì)胞進(jìn)行治療,包括但不限于非霍奇金淋巴瘤和慢性淋巴細(xì)胞白血病。其他應(yīng)用可以是治療自體免疫疾病和治療移植相關(guān)性反應(yīng)。該療法可以基于(但不限于)￠-粒子的輻射或a-粒子的輻射，或者這兩者的一個(gè)組合。該療法可以作為單藥療法給予，或者與其他療法，優(yōu)選標(biāo)準(zhǔn)治療方法組合來給予。這些其他療法可以是預(yù)治療、手術(shù)、化學(xué)療法、免疫療法、光動(dòng)力療法、放射免疫療法，或者這些療法中兩種或多種的一個(gè)組合。給予是指靜脈內(nèi)輸注或靜脈內(nèi)注射。更具體地說，本發(fā)明的放射免疫偶聯(lián)物可以通過連接到一個(gè)滴注器的一個(gè)周邊導(dǎo)管直接給予到一條靜脈中，該滴注器以防止空氣栓塞，并且允許對流入患者體內(nèi)的速率進(jìn)行估算。在一個(gè)實(shí)施方案中，該放射免疫偶聯(lián)物可以按一種重復(fù)的方式給予。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，該放射免疫偶聯(lián)物可以按一種重復(fù)的方式，但用多種不同的放射性核素給予，例如，可以在3 -放射免疫療法之后進(jìn)行a-放射免疫療法，或反之亦然。本發(fā)明的一個(gè)方面涉及本發(fā)明的放射免疫偶聯(lián)物的用途，用于治療B細(xì)胞惡性腫瘤。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案涉及本發(fā)明的放射免疫偶聯(lián)物的使用，該放射免疫偶聯(lián)物是組合或連同其他療法一起給予。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，其他療法選自預(yù)治療、化學(xué)療法、單克隆抗體療法、手術(shù)、放射療法和/或光動(dòng)力療法。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，其他療法是骨髓移植或干細(xì)胞移植和/或療法。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案包含先使用抗CD20和/或抗CD37的單克隆抗體進(jìn)行治療性預(yù)治療，然后用本發(fā)明的放射免疫偶聯(lián)物進(jìn)行治療。本發(fā)明的一個(gè)方面涉及一種用于對選自非霍奇金淋巴瘤和慢性淋巴細(xì)胞的一種B細(xì)胞惡性腫瘤進(jìn)行治療的方法，包括給予有效量的本發(fā)明的藥物組合物。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中,抗體劑量是每位患者I到IOOOmg,更優(yōu)選每位患者5到50mg，并且mLu的量為每公斤體重I到200MBq，更優(yōu)選為每公斤體重10到lOOMBq。試劑盒本發(fā)明的一個(gè)方面涉及一種用于制備本發(fā)明的放射免疫偶聯(lián)物的試劑盒，包含兩個(gè)或更多個(gè)小瓶，其中一個(gè)小瓶含有一種偶聯(lián)物，該偶聯(lián)物包含與一種鼠類單克隆抗體HHl連接的一種螯合劑；并且一個(gè)第二小瓶含有一種放射性核素。一個(gè)試劑盒可能需要進(jìn)行一些程序，例如在輸注前進(jìn)行放射性標(biāo)記和/或純化。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案涉及一種本發(fā)明的試劑盒，其中一個(gè)或數(shù)個(gè)小瓶的內(nèi)含物是經(jīng)過凍干的或是呈一種溶液的形式。通過將兩個(gè)小瓶的內(nèi)含物混合以產(chǎn)生放射免疫偶聯(lián)物，將得到最終產(chǎn)物。因此，在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，該放射免疫偶聯(lián)物是通過將兩個(gè)小瓶的內(nèi)含物混合來產(chǎn)生。此產(chǎn)物可能需要在使用前進(jìn)行純化。實(shí)例 實(shí)例I-對HHl進(jìn)行放射性標(biāo)記碘化根據(jù)制造商的描述，使用預(yù)先涂有I0D0GEN的碘化管(Pierce, Rockford, IL),通過間接碘化法,利用125I對抗體進(jìn)行標(biāo)記。 用111In和mLu進(jìn)行標(biāo)記首先，使抗體與一種螯合劑(p-SCN-Bn-DTPA或p-SCN-Bn-DOTA )反應(yīng)。將DTPA或DOTA螯合劑按5:1的比率溶解于0.05M HCl中，隨后加入該抗體中，通過用碳酸鹽緩沖液洗滌，將其PH調(diào)到約8。接著再次檢查pH，并且在必要時(shí)加以調(diào)整。在室溫下，將該溶液振蕩60分鐘，隨后通過加入50 u I 200mM甘氨酸溶液(每毫克抗體)來終止反應(yīng)。為了除去游離的螯合劑，用PBS (PAA)將經(jīng)過偶聯(lián)的抗體洗滌4到5次，接著通過用乙酸銨洗滌，將調(diào)到pH 5。然后，將111In或177Lu (Perkin Elmer, Boston, Ma，USA)加到0. 5mg DOTA-Ab中，并在42° C下振蕩I小時(shí)。最后,通過在一個(gè)凝膠過濾柱(例如SephadexG-25PD10，來自GE health ;或類似凝膠柱)上洗脫來純化產(chǎn)物?？倶?biāo)記產(chǎn)率在17%到63%間變動(dòng)。使用淋巴瘤細(xì)胞和一種經(jīng)過改進(jìn)的Lindmo法來測量放射免疫偶聯(lián)物的品質(zhì)。使用每毫升達(dá)108個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞濃度來補(bǔ)償111In-偶聯(lián)物的最適度的比活性。對于125I-偶聯(lián)物(具有更高的比活性)，使用每毫升達(dá)4X IO7個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞濃度就已足夠。這些放射免疫偶聯(lián)物的免疫活性和比活性可以參見表I。實(shí)例2-結(jié)合參數(shù)利用一步曲線擬合方法(Dahle等人2007)，測定締合速率常數(shù)ka、平衡解離常數(shù)Kd以及結(jié)合位點(diǎn)的平均數(shù)目Bmax。對HHl和利妥昔單抗針對Raji、Rael以及Daudi細(xì)胞三種不同的淋巴瘤細(xì)胞系的結(jié)合參數(shù)進(jìn)行測量(表2)。隨時(shí)間和抗體濃度的變化來測量特異性結(jié)合，并且使用締合速率常數(shù)ka、平衡解離常數(shù)Kd以及結(jié)合位點(diǎn)的平均數(shù)目Bmax作為參數(shù)，將描述抗原-抗體絡(luò)合物的凈形成速率的差分方程的解與實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)點(diǎn)相擬合。使用每毫升五百萬個(gè)細(xì)胞、4種濃度的標(biāo)記有125I的抗體(100ng/ml、1000ng/ml、5000ng/ml以及10000ng/ml)以及7個(gè)培養(yǎng)時(shí)間點(diǎn)(5分鐘、10分鐘、20分鐘、30分鐘、I小時(shí)、I. 5小時(shí)以及2小時(shí))。培養(yǎng)后，用PBS將細(xì)胞洗滌兩次，隨后在一個(gè)Y計(jì)數(shù)器中進(jìn)行計(jì)數(shù)。實(shí)例3-結(jié)合細(xì)胞的抗體的保留度在將Raji、Rael 和 Daudi 細(xì)胞與 111In-HHU111In-利妥昔單抗、125I-HHl 和 125I-利妥昔單抗一起孵育后，對洗滌后立即和洗滌后96小時(shí)的時(shí)候與細(xì)胞結(jié)合的抗體的保留度進(jìn)行測量(圖I)。 在含有10%胎牛血清、1%L-谷氨酰胺和1%青霉素/鏈霉素的I mlRPMI 1640培養(yǎng)基中，將一百萬個(gè)細(xì)胞與I y g/ml標(biāo)記有125I或標(biāo)記有111In的HHl或利妥昔單抗一起孵育I小時(shí)，用培養(yǎng)基洗滌兩次，并且再孵育4天。在洗滌后立即(

圖1A)以及在培養(yǎng)4天后(圖1B)對結(jié)合細(xì)胞的活性進(jìn)行測定，該測定是通過測量細(xì)胞數(shù)目(Vi細(xì)胞活力分析儀(Vi CellViability Analyzer), Beckman Coulter, Fullerton, CA, USA),并且利用一種經(jīng)過校準(zhǔn)的Y 檢測器(Cobra II 自動(dòng) Y 檢測器，Packard Instrument Company, Meriden, CT, USA)測量放射物的量來進(jìn)行。實(shí)例4-在體外用mLu-HHl或mLu-利妥昔單抗治療淋巴瘤細(xì)胞實(shí)驗(yàn)I : mLu-HHl結(jié)合于Daudi細(xì)胞將Iml的Daudi細(xì)胞懸浮液(一百萬個(gè)細(xì)胞/ml)播種于24個(gè)管中，并且用IOOii g/ml的HHl或利妥昔單抗阻斷半數(shù)的管，并在37° C下孵育30分鐘。隨后，向每一個(gè)管中加A 177Lu-HHl或mLu-利妥昔單抗，達(dá)到0、1、2. 5、5、10或20 y g/ml的最終濃度，并且再在37° C下進(jìn)行孵育。mLu-HHl的比活性為91. ekBq/yg，并且mLu-利妥昔單抗的比活性為 136.6kBq/U g。在孵育期間，利用一種Y檢測器(Cobra II自動(dòng)、檢測器,Packard InstrumentCompany)測量增加的活性量。2小時(shí)后，對半數(shù)的細(xì)胞進(jìn)行洗滌，并且對結(jié)合細(xì)胞的活性進(jìn)行測量(圖2A)，同時(shí)將另外一半的細(xì)胞孵育過夜(18小時(shí))，之后進(jìn)行洗滌以及結(jié)合細(xì)胞的活性的測量。在2小時(shí)的孵育后，與HHl —起孵育的細(xì)胞和與利妥昔單抗一起孵育的細(xì)胞之間沒有差異，而在18小時(shí)的孵育后，與利妥昔單抗一起孵育的細(xì)胞的結(jié)合細(xì)胞的活性是與HHl 一起孵育的細(xì)胞的兩倍(圖2)。表3和表4指出，與利妥昔單抗相比較，經(jīng)過放射性標(biāo)記的HHl使抗原飽和更快并且抗體濃度更低。這兩種放射免疫偶聯(lián)物(RIC)的非特異性結(jié)合看起來類似，并且該非特異性結(jié)合隨著培養(yǎng)基中RIC濃度的增加而增加。利妥昔單抗特異性結(jié)合mLu的最大數(shù)目是HHl的大約兩倍。然而，在lug/ml劑量下，特異性結(jié)合的放射性原子的數(shù)目幾乎沒有差異。實(shí)驗(yàn)II :與177Lu-IgG 一起孵育2小時(shí)細(xì)胞生長數(shù)據(jù)如同實(shí)驗(yàn)I，將Daudi細(xì)胞與放射免疫偶聯(lián)物一起孵育(圖2A)。通過將來自每一個(gè)管的50，000個(gè)細(xì)胞播種于六個(gè)12孔板中的三個(gè)孔中，來測量在與177Lu-HHl或177Lu-利妥昔單抗一起孵育2小時(shí)后Daudi細(xì)胞的生長情況。使用自動(dòng)成像系統(tǒng)(Clone Select Imager, Gentix Ltd, Hampshire, UK)測量在接下來 14 天中數(shù)個(gè)時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞量。未經(jīng)過標(biāo)記的抗體單獨(dú)對細(xì)胞生長沒有影響。然而，用mLu-抗體處理過的阻斷的細(xì)胞的生長明顯不如未處理過的對照細(xì)胞快，這表明未結(jié)合的mLu-抗體或未特異性結(jié)合的mLu-抗體對細(xì)胞具有影響(圖3)。用mLu-抗體處理未被阻斷的細(xì)胞使得用10 u g/ml 177Lu-HHl處理的細(xì)胞的生長延遲出現(xiàn)44%的增加(圖3A)，并且使得用10 u g/ml mLu-利妥昔單抗處理的細(xì)胞的生長延遲出現(xiàn)31%的增加(圖3B)。
對于用20y g/ml進(jìn)行處理，這兩種抗體之間的差異甚至更大，因?yàn)橛胢Lu-HHl處理過的細(xì)胞不存在再生長。這一結(jié)果是出乎意料的，因?yàn)檫@些細(xì)胞都是用相同量的抗體進(jìn)行標(biāo)記的(圖2A)。實(shí)驗(yàn)III :與mLu-IgG —起孵育18小時(shí)細(xì)胞生長數(shù)據(jù)如同實(shí)驗(yàn)I，將Daudi細(xì)胞與放射免疫偶聯(lián)物一起孵育(圖2B)。通過將來自每一個(gè)管的50，000個(gè)細(xì)胞播種于六個(gè)12孔板中的三個(gè)孔中，來測量在與177Lu-HHl或177Lu-利妥昔單抗一起孵育18小時(shí)后Daudi細(xì)胞的生長情況。使用自動(dòng)成像系統(tǒng)(CloneSelect Imager, Gentix Ltd, Hampshire, UK),測量在接下來14天中的數(shù)個(gè)時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞量。未經(jīng)過標(biāo)記的抗體單獨(dú)對細(xì)胞生長沒有影響。由于與放射免疫偶聯(lián)物在培養(yǎng)基中孵育的時(shí)間增加了16小時(shí)，本實(shí)驗(yàn)(圖4)中對用177Lu-抗體處理過的阻斷的細(xì)胞的細(xì)胞生長抑制作用大于實(shí)驗(yàn)II中的情形(圖3)。用mLu-抗體處理未阻斷的細(xì)胞使得用2. 5 u g/ml 177Lu-HHl處理過的細(xì)胞的生長延遲出現(xiàn)了 107%的增加(圖4A)，并且使得用2. 5 u g/ml mLu-利妥昔單抗處理過的細(xì)胞的生長延遲出現(xiàn)了 52%的增加(圖4B)。這一結(jié)果是出乎意料的，因?yàn)樵?8小時(shí)的孵育后，標(biāo)記有mLu-利妥昔單抗的細(xì)胞的結(jié)合細(xì)胞的活性是標(biāo)記有mLu-HHl的細(xì)胞的兩倍(圖2B)。 實(shí)例5-HH1的生物分布用在研究開始時(shí)帶有32-256mm3尺寸的Daudi異種移植物的BALB/c-裸(nu/nu)小鼠來研究經(jīng)過mIn標(biāo)記的HHl的生物分布。使用pSCN-Bz-DOTA作為一種雙官能螯合劑，與放射性核素絡(luò)合，并且將該放射性核素附接到抗體，由此進(jìn)行放射性標(biāo)記(參見實(shí)例I)。通過對每只動(dòng)物的尾靜脈注射100 u I溶液來給予這些制劑。在每只動(dòng)物中注射120kBq的活性物。每一時(shí)間點(diǎn)使用五只動(dòng)物。在注射后的不同時(shí)間點(diǎn)，在實(shí)施頸椎脫白法后進(jìn)行尸體解剖。測定各組織樣品的重量，并且借助一個(gè)經(jīng)過校準(zhǔn)的 Y 檢測器(Cobra II 自動(dòng) Y 檢測器，Packard Instrument Company,Meriden, CT, USA)來測量mIn。在這些測量程序中，使用注射物的樣品作為參照物。帶有Daudi異種移植物的小鼠在注射后24小時(shí)的111In-HHl攝取情況以及在正常組織中的生物分布提供于圖5中。經(jīng)過放射性標(biāo)記的抗體具有一種相關(guān)的腫瘤靶向性和生物分布。螯合劑-偶聯(lián)物111In-HHl在體內(nèi)顯示出良好的穩(wěn)定性。實(shí)例6-HH1與三種其他抗⑶37的抗體的比較實(shí)驗(yàn)I :抗⑶37的抗體針對經(jīng)過放射性標(biāo)記的HHl的抗原阻斷能力為了測試HHl抗原相互作用是否能被其他抗⑶37的抗體阻斷，通過將Daudi細(xì)胞與HH1、0. N. 108、IP0-24或6D263抗體一起預(yù)孵育來進(jìn)行阻斷。將Daudi細(xì)胞(二百萬個(gè)/毫升)與HH1、0.N. 108、IP0-24或6D263 (20 y g/ml) —起孵育15分鐘，并且加入經(jīng)過125I標(biāo)記的HHl抗體，并且孵育I小時(shí)。之后，對這些細(xì)胞進(jìn)行離心，并且洗滌3次，并使用一個(gè)X射線/ Y計(jì)數(shù)器對上清液中的活性物以及對細(xì)胞團(tuán)進(jìn)行計(jì)數(shù)。與被HHl阻斷的細(xì)胞相比較，標(biāo)記有125I的HHl的結(jié)合分?jǐn)?shù)分別比被0. N. 108、IP0-24或6D263阻斷的細(xì)胞高48%、44%和51%。因此，用HHl實(shí)現(xiàn)的125I-HHl對抗原結(jié)合的阻斷作用優(yōu)于這三種其他抗體，這表明抗原相互作用存在某些差異?？傊c一組三種其他抗⑶37的單克隆抗體相比較，HHl具有明顯不同的抗原結(jié)合特性。實(shí)驗(yàn)II :抗體結(jié)合于用石蠟包埋的淋巴瘤組織樣品為了對HHl與三種可商購的⑶37抗體結(jié)合于經(jīng)過固定的淋巴瘤樣品的能力進(jìn)行比較，將來自多位淋巴瘤患者的活體檢查樣品固定于福爾馬林(formalin)中，用石蠟包埋，并且切割成多個(gè)IOiim的切片，安放到物鏡上。用抗體HHl、IP0. 24、0N. 108和6D263對這些樣品進(jìn)行標(biāo)記，并且使用兔抗小鼠多克隆抗體和過氧化物酶染色來檢測所進(jìn)行的標(biāo)記的程度?？贵wIP0. 24和0N. 108對這些淋巴瘤樣品進(jìn)行的標(biāo)記最強(qiáng)。6D263抗體標(biāo)記的樣品略弱。HHl抗體對這些切片的標(biāo)記不明顯。因此，可以得出結(jié)論，由于HHl不結(jié)合，而三種其他抗⑶37的抗體進(jìn)行結(jié)合，故HHl具有一種明顯不同的抗原相互作用。 實(shí)驗(yàn)III :用HH1、IP0. 24、0N. 108和6D263抗體進(jìn)行的流式細(xì)胞術(shù)為了調(diào)查通過不同⑶37抗體對比通過HHl檢測的抗原表達(dá)的差異，用含有5%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基洗滌Daudi細(xì)胞兩次，并且在冰上，在含有10% FCS的0. 2ml培養(yǎng)基中用10 u g/ml的一次抗體HH1、IP0. 24,0N. 108以及6D363進(jìn)行標(biāo)記，持續(xù)0. 5小時(shí)。隨后，用含0. 25%FCS的PBS將這些細(xì)胞洗滌兩次，并且在冰上，用標(biāo)記有FITC的多克隆兔抗小鼠IgG Fab'2 (按1:20稀釋)進(jìn)行標(biāo)記(圖6)，持續(xù)0. 5小時(shí)。通過在流式細(xì)胞儀中用488nm激光激發(fā)，來檢測FITC標(biāo)記發(fā)出的熒光。使用前向散射、側(cè)向散射和碘化丙啶信號排除死亡的細(xì)胞和雙聯(lián)體(doublet)。各種⑶37抗體的不同F(xiàn)ITC柱形圖間沒有明顯變化(圖6)?？傊琀Hl與三種其他抗CD37的抗體IP0. 24,0N. 108以及6D363產(chǎn)生相似的流式細(xì)胞術(shù)柱形圖。實(shí)驗(yàn)IV =HHl以及三種可商購抗⑶37的抗體的結(jié)合分?jǐn)?shù)為了對HHl的結(jié)合分?jǐn)?shù)與O.N. 108、IP0-24或6D263抗體的結(jié)合分?jǐn)?shù)進(jìn)行比較(Santa Cruz,生物技術(shù)(Biotechnology)),使用 Daudi 細(xì)胞。用 HH1、0. N. 108、IP0-24 或6D263抗體(500ii g/ml)阻斷細(xì)胞懸浮液(表明抗原大量過量)，持續(xù)15分鐘，以引起抗體的非特異性結(jié)合，這些細(xì)胞懸浮液是由六千萬個(gè)Daudi細(xì)胞于含有5%胎牛血清的0. 2ml RPMI1640培養(yǎng)基中組成的。其他平行實(shí)驗(yàn)未被阻斷。隨后，加入經(jīng)過125I 標(biāo)記的 HH1、0.N. 108、IP0-24 或 6D263 抗體(5-10 ng/ml)，并且在輕微振蕩下，在4° C下將這些細(xì)胞孵育2小時(shí)。之后，對這些細(xì)胞進(jìn)行離心，并且用含1%FCS的PBS洗滌2次。將細(xì)胞團(tuán)轉(zhuǎn)移到多個(gè)潔凈的管中，并且使用一個(gè)Y計(jì)數(shù)器進(jìn)行計(jì)數(shù)。測定的結(jié)合分?jǐn)?shù)是未被阻斷的小瓶和阻斷的小瓶的活性與增加的活性的差異。HHl顯示出的結(jié)合分?jǐn)?shù)比其他CD37抗體的結(jié)合分?jǐn)?shù)高得多(表5)?？傊?dāng)按類似方式對抗體進(jìn)行放射性標(biāo)記時(shí)，HHl所顯示的針對活細(xì)胞的免疫活性比IP0. 24,0N. 108以及6D363高得多。這一結(jié)果表明，HHl具有與這三種其他抗體不同的抗原相互作用。實(shí)例7 -低鏈和重鏈可變區(qū)的DNA和氨基酸序列HHl抗⑶37抗體的可變區(qū)的基因和蛋白質(zhì)序列如下VHa CD37的基因序列對應(yīng)于SEQ ID NO: I并且VHa CD37的蛋白質(zhì)序列對應(yīng)于SEQID N0:2。VH a CD37gagatccagctgcagcagtctggacctgagctggtgaagcctggggcttcagtgaaggtaEIQLQQSGPELVKPGASVKV
tcctgcaaggcttctggttactcattcactgactacaacatgtactgggtgaagcagagcSCKASGYSFTDYNMYffV KQ ScatggaaagagccttgagtggattggatatattgatccttacaatggtgatactacctacHGKSLEffIGYIDPYNGD TT YaaccagaagttcaagggcaaggccacattgactgttgacaagtcctccagcacagccttcNQKFKGKATLTVDKSSSTAFatccatctcaacagcctgacatctgaggactctgcagtctattactgtgcaagatcccct
IHLNSLTSEDSAVYYCARSPtatggtcactatgctatggactactggggtcaaggaacctcagtcaccgtctcctcaYGHYAMDYffGQGTSVT VS SVLa CD37的基因序列對應(yīng)于SEQ ID NO: 3，并且VL a CD37的蛋白質(zhì)序列對應(yīng)于SEQ ID NO:4。VLaCD37gacattgtgatgacccagtctcacaaactcttgtccacatcagtaggagacagggtcagcDIVMTQSHKLLSTSVGDRVSatcacctgcaaggccagtcaggatgtgagtactgctgtagactggtatcaacagaaaccaITCKASQDVSTAVDffYQ QK PggacaatctcctaaactactgattaactgggcatccacccggcacactggagtccctgatGQSPKLLINffASTRHTG VP DcgcttcacaggcagtggatctgggacagattatactctcaccatcagcagtatgcaggctRFTGSGSGTDYTLTISSMQAgaagacctggcactttattactgtcgacaacattatagcactccattcacgttcggctcgEDLALYYCRQHYSTPFTFGSgggacaaagttggaaataaaaGTKLEIK該氨基酸序列明顯不同于結(jié)合⑶37的抗體AO的氨基酸序列(Heider等人，2009)。HHl的與AO的可變輕鏈之間的重疊部分達(dá)到56%，而可變重鏈之間的重疊部分是 82%。實(shí)例8-將經(jīng)過放射性標(biāo)記的HHl結(jié)合到用⑶20抗體利妥昔單抗飽和的細(xì)胞上。背景非霍奇金淋巴瘤患者常常接受利妥昔單抗作為一種標(biāo)準(zhǔn)療法。如果能夠?qū)@些患者使用經(jīng)過放射性標(biāo)記的HH1，那么即使他們正在經(jīng)歷利妥昔單抗療法，也將是有益的。表達(dá)⑶20和⑶37兩種抗原的Daudi淋巴瘤細(xì)胞被用作一種模型。方法用過量(100 U g/ml)的利妥昔單抗對Daudi淋巴瘤細(xì)胞(3，300, 000個(gè)/0. 5ml)進(jìn)行預(yù)處理和共同處理，持續(xù)五分鐘，之后加入Iu g標(biāo)記有125I的HHl，或在未進(jìn)行利妥昔單抗預(yù)處理情況下加入給定的標(biāo)記有125I的HH1。為了測定125I-HHl的非特異性結(jié)合，使用與上文相同的配置，但利用未經(jīng)過標(biāo)記的HH1(使用了 IOy g/ml)進(jìn)行預(yù)處理。室溫下，在PBS中將這些細(xì)胞孵育兩小時(shí)，并且在一個(gè)Y計(jì)數(shù)器中進(jìn)行計(jì)數(shù)，在ImlPBS中洗滌三次，之后離心，最后對細(xì)胞所結(jié)合的放射物進(jìn)行再計(jì)數(shù)。結(jié)果在用利妥昔單抗進(jìn)行預(yù)處理/共同處理的情況下，加入的125I-HHl中有26. 0% (總結(jié)合27. 4%-非特異性結(jié)合I. 4%)特異性結(jié)合于細(xì)胞。在不用利妥昔單抗進(jìn)行預(yù)處理/共同處理的情況下，25. 5% (26. 9-I. 4)特異性結(jié)合(所有數(shù)字都表示三次平行實(shí)驗(yàn)的平均值)。也就是說，由于存在利妥昔單抗，使得125I-HHl的結(jié)合無明顯差異。結(jié)論用過量的利妥昔單抗進(jìn)行預(yù)處理和共同處理不會(huì)改變經(jīng)過放射性標(biāo)記的HHl的細(xì)胞結(jié)合能力，并且因此，不會(huì)阻止與CD37抗原的接近。 這表明，用經(jīng)過放射性標(biāo)記的HHl進(jìn)行的放射免疫療法可以適合于接受了或正在接受用抗CD20的抗體進(jìn)行的免疫療法的患者以及未用利妥昔單抗治療過的患者。實(shí)例9-使用mLu-HHl治療經(jīng)靜脈內(nèi)接種了 Daudi淋巴瘤細(xì)胞的SCID小鼠。背景用當(dāng)前針對CD20的放射免疫療法來治療淋巴瘤患者可能會(huì)因抗原漂移以及可能發(fā)生的⑶抗原阻斷而為先前曾用利妥昔單抗治療過的患者帶來問題。因此，以其他抗原為目標(biāo)的放射免疫療法可能更有效。通過對重度聯(lián)合免疫缺陷(severe combined immunedefCient，SCID)小鼠靜脈內(nèi)注射人類淋巴瘤細(xì)胞，建立一個(gè)靜脈內(nèi)腫瘤模型。當(dāng)對SCID小鼠靜脈內(nèi)接種Daudi淋巴瘤細(xì)胞時(shí)，這些小鼠將會(huì)因Daudi腫瘤細(xì)胞的生長而發(fā)生后肢癱瘓。實(shí)驗(yàn)在給予50 或 100MBq/kg 177Lu-HHl、50 ii g HHl、50 ii g 利妥昔單抗或 NaCl 的前一周，對SCID小鼠靜脈內(nèi)注射一千萬個(gè)Daudi細(xì)胞。每隔一周監(jiān)測小鼠的后肢癱瘓情況和體重?fù)p失，以及WBS計(jì)數(shù)。使用無癥狀存活期中斷作為終點(diǎn)。為了制備經(jīng)過放射性標(biāo)記的抗體，首先用p-SCN-Bn-DOTA對HHl進(jìn)行標(biāo)記，并且將其純化。更換緩沖液后，將mLu(PerkinElmer, Boston, Ma, USA)加入D0TA-HH1中，并且在40° C下振蕩40分鐘。終產(chǎn)物的比活性為約3200MBq/mkg。將每一制劑溶解于等滲鹽水中，達(dá)到每只動(dòng)物IOOiU的總注射體積。結(jié)果中值無癥狀存活期對于鹽水為26天(在21到33天的范圍內(nèi))，對于HHl為40天(在23到44天的范圍內(nèi))，并且對于利妥昔單抗為40天(在33到44天的范圍內(nèi))(圖8)。對于50kBq/kg mLu-HHl,在79天后有80%的動(dòng)物仍存活。在100kBq/g組中有兩只小鼠死亡于鹽水組中任一動(dòng)物之前,并且血細(xì)胞計(jì)數(shù)指示存在放射毒性。該100kBq/g組中三分之一的動(dòng)物在第49天時(shí)死亡。其他動(dòng)物(70%)在第79天時(shí)仍存活。用mLu-HHl治療的小鼠的存活率明顯高于用NaCl、HHl或利妥昔單抗治療的小鼠的存活率(p〈0. 005, Mann Whitney時(shí)序測試)。結(jié)論數(shù)據(jù)顯示，接受每克體重(b.w) 50或IOOkBq劑量mLu-HHl的各組的存活率明顯優(yōu)于接受鹽水或者用HHl或利妥昔單抗進(jìn)行的免疫療法的組的存活率。毒性數(shù)據(jù)表明，活性應(yīng)該保持每克體重小于100kBq。這些數(shù)據(jù)表明，177Lu-HHl具有相關(guān)的體內(nèi)放射免疫療法的特性。實(shí)例IO-mLu-HHl在帶有表達(dá)⑶37的腫瘤異種移植物的裸小鼠中的生物分布。背景對經(jīng)過镥-177標(biāo)記的HHl抗體的體內(nèi)組織分布和腫瘤靶向性進(jìn)行評估。實(shí)驗(yàn)程序用放射性核素對抗體進(jìn)行標(biāo)記
首先用螯合劑p-SCN-Bn-DOTA對抗體進(jìn)行標(biāo)記。將DOTA溶解于0. 05M HCl中，將其按5 I的比率加入該抗體中，并且通過使用30kDa截留分子量的Amicon離心過濾管(Millipore, USA)，用碳酸鹽緩沖液洗滌，將pH調(diào)到8_9。隨后再次檢查pH，并且在必要時(shí)加以調(diào)整。室溫下，將該溶液振蕩60分鐘，隨后通過加入50iU 200mM甘氨酸溶液(每毫克抗體)終止反應(yīng)。為了除去游離的螯合劑，用PBS(PAA)(使用Amicon和離心法)將偶聯(lián)的抗體洗滌4到5次，隨后通過用乙酸銨洗滌調(diào)到PH5。接著，將 177Lu (Perkin Elmer, Boston, Ma, USA)與 0. 5mg DOTA-HHl 合并于一個(gè) 2ml 的聚丙烯管(Eppendorf, Germany)中，并且在40° C下振蕩I小時(shí)。mLu-偶聯(lián)物的比活性通常為 25_120MBq/kg。免疫活性使用淋巴瘤細(xì)胞和一種經(jīng)過改進(jìn)的Lindmo法來測量放射免疫偶聯(lián)物的品質(zhì)。所用細(xì)胞濃度為每毫升最多108個(gè)細(xì)胞。這些實(shí)驗(yàn)中使用的偶聯(lián)物的免疫活性高于50%。放射免疫偶聯(lián)物的生物分布對三周前植入了 I I Imm Daudi腫瘤異種移植物的雄性BALB/c裸(nu/nu)小鼠中177Lu-HHl的生物分布進(jìn)行測定。通過對每只動(dòng)物的尾靜脈注射IOOiU溶液來給予這些制劑。對于mLu-HHl,每只小鼠的平均活性為500kBq。每一時(shí)間點(diǎn)使用四到五只動(dòng)物。在注射后各個(gè)時(shí)間點(diǎn)，在實(shí)施頸椎脫白法后進(jìn)行尸體解剖。測定每一組織樣品的重量，并且利用一種經(jīng)過校準(zhǔn)的Y檢測器(Cobra II自動(dòng)Y檢測器,Packard Instrument Company,Meriden, CT, USA)測量mLu。在這些測量程序中，使用注射物樣品作為參照物。結(jié)果與討論在帶有Daudi異種移植物的BALB/c_裸(nu/nu)雌性小鼠的正常組織中標(biāo)記有177Lu的HHl的攝取和保留度于圖7中呈現(xiàn)。在放射免疫偶聯(lián)物的初始攝取之后來自任何器官/加到任何器官的核素沒有發(fā)生再分布的跡象，這表明這些放射免疫偶聯(lián)物是穩(wěn)定的。在帶有腫瘤的裸小鼠中注射mLu-HHl顯示，在骨骼中存在較少攝取。已知游離的177Lu積聚于骨骼中，因此這一結(jié)果表明，該放射免疫偶聯(lián)物在體內(nèi)是穩(wěn)定的。在稍后時(shí)間點(diǎn)時(shí)，腫瘤中的攝取明顯高于其他器官中的攝取。這表明，對于使用HHl抗體的放射免疫療法，177Lu具有相關(guān)的半衰期。在表達(dá)⑶37的腫瘤異種移植物中mLu-HHl的生物分布數(shù)據(jù)顯示出一種相關(guān)的正常組織攝取和清除以及顯著的保留度。HHl抗體看起來特別適合放射免疫療法。mLu-HHl偶聯(lián)物看起來特別適合，因?yàn)樵诖蟛糠址派湫院怂厮プ兦埃@得了有利的腫瘤與正常組織之比。表格表I
多種放射免疫偶聯(lián)物的免疫活性和比活性。
放射免疫偶聯(lián)物 IRF1 (%)比活性1 (MBq/mg) 尹
驗(yàn)編號
125I-HH I66 士 17 (39-92) 75 土 15 (51-104)17
111In-HHl66- 14(51-78) 22± 12 (9-32)
3
177Lu-HHl5692I
125T-利妥昔單抗 62 士 6 (54-68) 69 ±30 (34-118)6
liiIn-利妥昔單抗 4516I
177Lu-利妥昔單抗 60137
I1平均值土標(biāo)準(zhǔn)偏差(范圍)表2對于抗體利妥昔單抗和HHl，Raji、Rael和Daudi細(xì)胞上抗原的平均數(shù)目(Bmax)、平衡解離常數(shù)(Kd)和締合速率常數(shù)(ka)。
抗體細(xì)胞系 Bmax (抗原/細(xì)胞) Kd (nM) ka
(nM/h)
HHlRaji 146 000 ±7 600 6.3 士 1.7 0.36 ±0.14
HHlRael 263 000 ± 27 000 12.7 ±5.5 0.07 ±0.01
HHlDaiidi 340 000 ± 5 000 2.7 ±0.3 0.72 ± 0.07
利妥昔單抗 Raji 272 000 士 69 000 4.8 土 0.9 0.08 士0.006
利妥昔單抗 Rael 626 000 ± 36 000 12.0 士 2.0 0.08 土
0.007表3
孵育2小時(shí)后每個(gè)Daudi細(xì)胞所結(jié)合的mLu原子數(shù)目。
權(quán)利要求
1.一種結(jié)合人類⑶37的放射免疫偶聯(lián)物，包含 a)鼠類單克隆抗體HHl， b)一個(gè)連接子，以及 c)一種放射性核素，該放射性核素選自由以下各項(xiàng)組成的組，即177Lu、211At、213Bi、212Bi,212Pb, 225Ac, 227Th,90Y, 186Re, 188Re, 199Au, 194Ir, 166Ho, 159Gd, 153Sm, 149Pm, 142Pr, 111Ag, 109Pd,77As、67Cu 以及 47Sc。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的結(jié)合CD37的放射免疫偶聯(lián)物，其中該連接子是一種螯合性連接子。
3.根據(jù)權(quán)利要求I到2中任一項(xiàng)所述的結(jié)合CD37的放射免疫偶聯(lián)物，其中該放射性核素是177Lu。
4.一種藥物組合物，包含根據(jù)權(quán)利要求I到3中任一項(xiàng)所述的放射免疫偶聯(lián)物和一種藥學(xué)上可接受的載體。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的藥物組合物，另外包含一種或多種另外的抗體或放射免疫偶聯(lián)物。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的藥物組合物，其中該一種或多種另外的抗體或放射免疫偶聯(lián)物以CD20為目標(biāo)。
7.根據(jù)權(quán)利要求4到6中任一項(xiàng)所述的藥物組合物，用于對表達(dá)該⑶37抗原的B細(xì)胞惡性細(xì)胞進(jìn)行治療。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的藥物組合物，用于治療非霍奇金淋巴瘤和慢性淋巴細(xì)胞白血病。
9.一種根據(jù)權(quán)利要求I到3中任一項(xiàng)所述的放射免疫偶聯(lián)物的用途，用于治療B細(xì)胞惡性腫瘤。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的用途，其中該放射免疫偶聯(lián)物是組合或連同另一種療法一起給予的。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的用途，其中該療法選自預(yù)治療、化學(xué)療法、單克隆抗體療法、手術(shù)、放射療法和/或光動(dòng)力療法。
12.根據(jù)權(quán)利要求10或11所述的用途，其中該療法包含在用根據(jù)權(quán)利要求I到3中任一項(xiàng)所述的放射免疫偶聯(lián)物進(jìn)行治療之前，使用抗CD20和/或抗CD37的單克隆抗體進(jìn)行預(yù)治療。
13.一種用于對選自非霍奇金淋巴瘤和慢性淋巴細(xì)胞白血病的一種B細(xì)胞惡性腫瘤進(jìn)行治療的方法，包括給予一個(gè)有效量的根據(jù)權(quán)利要求4到8中任一項(xiàng)所述的藥物組合物。
14.一種用于制備根據(jù)權(quán)利要求I到3中任一項(xiàng)所述的放射免疫偶聯(lián)物的試劑盒，包含兩個(gè)或更多個(gè)小瓶，其中一個(gè)小瓶含有一種偶聯(lián)物，該偶聯(lián)物包含與一種鼠類單克隆抗體HHl連接的一種螯合劑；并且一個(gè)第二小瓶含有一種放射性核素。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的試劑盒，其中這些小瓶中一個(gè)或數(shù)個(gè)的內(nèi)含物是經(jīng)過凍干的或呈一種溶液的形式。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種結(jié)合人類CD37的放射免疫偶聯(lián)物。用于治療癌癥，特別是B細(xì)胞惡性腫瘤的多種藥物組合物和其多種用途是本發(fā)明涉及的方面。
文檔編號A61K51/10GK102762230SQ201180007272
公開日2012年10月31日 申請日期2011年1月28日 優(yōu)先權(quán)日2010年1月29日
發(fā)明者奧伊溫德·S·布呂蘭, 約斯泰因·達(dá)勒, 羅伊·H·拉森 申請人:諾帝克納諾維科特公司