專(zhuān)利名稱(chēng)：腫瘤疫苗的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種生物制品的制備方法，特別是細(xì)胞水平腫瘤疫苗的制備。
近年來(lái)人們已將腫瘤疫苗的開(kāi)發(fā)研究列入四大抗癌生物工程產(chǎn)品之一。采用各種方法和技術(shù)(包括化學(xué)和生化方法、單克隆抗體以至基因工程技術(shù)等)，從腫瘤細(xì)胞提取或克隆表達(dá)出高純度的TAA(見(jiàn)李春海、孫志賢主編的《腫瘤標(biāo)志研究進(jìn)展》刊物中樊代明的文章〈腫瘤疫苗的研究進(jìn)展〉34-39，1992)這要求有較高的技術(shù)和設(shè)備條件，費(fèi)時(shí)、費(fèi)錢(qián)，不僅難以推廣應(yīng)用，而且這種高純度TAA產(chǎn)品的主動(dòng)免疫抗癌療效尚有待臨床驗(yàn)證。最近有資料(如在MG.Hannaetal.In“PrinciplesofCancerBiotherapy”，RKOldham(ed).2ndEdpp253～283MarcelDekkerInc.NewYork，1991)介紹，目前國(guó)外臨床應(yīng)用的瘤苗就是分別用放射能(X-線(xiàn)、鈷60等)或抗癌藥(如絲裂霉素C，即MMC)或病毒(痘苗病毒)處理的，雖已取得一定療效，但其不足之處在于單因素處理療效有限;而且都是采用新鮮或液氮凍存的腫瘤細(xì)胞，滅能，要求有專(zhuān)門(mén)設(shè)備(如放射能)或不易控制(如MMC、病毒)或現(xiàn)用現(xiàn)做，耗能費(fèi)時(shí)，既不方便更難保存。
鑒于上述現(xiàn)有技術(shù)中的不足之處本發(fā)明的目的在于提供一種療效高、滅能徹底、使用安全、保存方便、簡(jiǎn)單易行的腫瘤疫苗的制備方法。
本發(fā)明的目的可通過(guò)以下措施來(lái)實(shí)現(xiàn)一種腫瘤疫苗的制備方法，首先要制備單個(gè)瘤細(xì)胞懸液，即將腫瘤組織制成1mm3的小塊，洗滌后依次用胰酶(0.14%)、DNA酶(0.03%)消化，置4℃8～16小時(shí)，再經(jīng)搖床震蕩30分鐘，然后用200目不銹鋼網(wǎng)過(guò)濾，濾液被離心洗滌之后用氯化銨緩沖液處理，可得到單個(gè)瘤細(xì)胞懸液，其特征在于細(xì)胞水平瘤苗的制備如下
Ⅰ型瘤苗將上述單個(gè)瘤細(xì)胞懸液與等體積的200～400μg/ml的莪術(shù)油或100～200μg/ml的β欖香烯及終濃度為50～100μg/ml的MMC處理60～120分鐘，離心洗滌后加入醛類(lèi)固定劑，再與短小棒狀桿菌(CP)混合成為混合瘤苗;或Ⅱ型瘤苗向上述單個(gè)瘤細(xì)胞懸液加入新城雞瘟病毒(NDV)按100-1000血凝單位(HU)/3×106-7瘤細(xì)胞或者用紫外線(xiàn)滅能的痘苗病毒(UV-VV)按感染倍數(shù)(Moi)為10的比例處理，于37℃、5%CO2下溫育4小時(shí)，離心洗滌后再分別與等體積的200～400μg/ml莪術(shù)油或100～200μg/mlβ-欖香烯混合，再于37℃溫育30～60分鐘，離心后向細(xì)胞沉淀加入醛類(lèi)固定劑并與CP混合，或Ⅲ型瘤苗向上述單個(gè)瘤細(xì)胞懸液加入新城雞瘟病毒(NDV)按100～1000血凝單位(HU)/3×106-7瘤細(xì)胞或者用紫外線(xiàn)滅能的痘苗病毒(UV-VV)按感染倍數(shù)(Moi)為10的比例處理，于37℃、5%CO2下溫育4小時(shí)，離心洗滌后再分別與等體積的200～400μg/ml莪術(shù)油+MMC或100～200μg/mlβ-欖香烯+MMC混合，再于37溫育30～60分鐘，離心后向細(xì)胞沉淀加入醛類(lèi)固定劑并與CP混合。最好醛類(lèi)固定劑為0.0125%的戊二醛。
本發(fā)明的方法主要是采用抗癌中藥莪術(shù)及其有效成分β欖香烯直接處理腫瘤細(xì)胞制備細(xì)胞水平的瘤苗;經(jīng)過(guò)多因素綜合處理后用醛類(lèi)固定劑固定;并與佐劑短小棒狀桿菌(CorynebacteriumParvum即CP混合制成混合瘤苗。
一、本發(fā)明細(xì)胞水平瘤苗的制備方法1.首先制備單個(gè)瘤細(xì)胞懸液將在無(wú)菌條件下手術(shù)切除的各種實(shí)體瘤患者的新鮮腫瘤標(biāo)本(包括原發(fā)瘤及/或轉(zhuǎn)移瘤)于取材供病理組織學(xué)檢(復(fù))查后，按常規(guī)方法除去包膜、結(jié)締組織及出血壞死腫瘤組織，選取新鮮腫瘤組織剪成1mm3大小碎塊，洗滌數(shù)次，依次用胰酶(0.14%)、DNA酶(0.03%)消化，置4℃處理8～16小時(shí)，如為膠原含量較多的瘤塊則改用0.14%的膠原酶Ⅳ(即COⅡagenaseⅣ)消化。然后將經(jīng)酶消化的瘤組織用搖床震蕩30分鐘，之后用200目不銹鋼網(wǎng)過(guò)濾，將濾液離心洗滌，再用155mM的氯化銨緩沖溶液去除其中的紅細(xì)胞再混懸即成為單個(gè)瘤細(xì)胞懸液，如系癌性胸腹水則不必經(jīng)過(guò)酶消化過(guò)程，即可直接制備成濃度為3×107～3×108個(gè)/ml單個(gè)瘤細(xì)胞懸液。
2.細(xì)胞水平瘤苗的制備它是以抗癌中藥莪術(shù)油(OleumCurcumaaromatica縮寫(xiě)為OCA)及其有效成分β-欖香烯(βelemene)為主，結(jié)合化療藥物如絲裂毒素C(MMC)及/或病毒如痘苗病毒(VacciniaVirus，簡(jiǎn)寫(xiě)為VV)或新城雞瘟病毒(Newcastlediseasevirus，簡(jiǎn)寫(xiě)為NDV)進(jìn)行復(fù)合處理，并用醛類(lèi)如戊二醛、多聚甲醛、甲醛滅能固定，即可制備出三種復(fù)合處理的細(xì)胞水平瘤苗，如下表所示。
表1是經(jīng)復(fù)合方法處理制備的瘤苗類(lèi)型。
瘤苗類(lèi)型復(fù)合處理方法Iβ-欖香烯(或OCA)+MMCII病毒(VV或NDV)+β-欖香烯(或OCA)III病毒(VV或NDV)+β-欖香烯(或OCA)+MMC其中Ⅰ型瘤苗經(jīng)醛類(lèi)固定劑滅能固定，并與短小棒狀桿菌菌苗(CP死菌苗)混合成混合瘤苗供臨床主動(dòng)免疫治療之用。余下Ⅱ、Ⅲ型瘤苗均先經(jīng)過(guò)病毒處理，然后再用β-欖香烯或β-欖香烯-MMC處理，最后用醛類(lèi)固定劑滅能固定，加入CP混合備用。
上表中細(xì)胞水平瘤苗的制備工藝過(guò)程分兩種第一種是不采用病毒處理的工藝如Ⅰ型瘤苗，第二種是先用病毒處理后再用與前述的第一種方法相同的方式處理。其中不采用病毒處理的工藝即直接用藥物(中藥和西藥)處理腫瘤細(xì)胞，具體方法是所用的中藥有莪術(shù)油2%乳劑，或β-欖香烯2%乳劑或β-欖香烯0.2%注射液，先分別用生理鹽水稀釋?zhuān)渲休g(shù)油的濃度為200～400μg/ml，β-欖香烯的濃度為100～200μg/ml。然后將它們與等體積的腫瘤細(xì)胞懸液混合，于37℃溫育30～60分鐘，(當(dāng)用臺(tái)盼蘭排除法測(cè)定所處理的腫瘤細(xì)胞蘭染率達(dá)50%左右時(shí))加入西藥MMC，使MMC的終濃度為50～100μg/ml，繼續(xù)處理30～60分鐘離心洗滌，然后再加入醛類(lèi)固定劑如0.0125%的戊二醛或2%的多聚甲醛或10%福爾馬林(甲醛)固定液，用這種中西藥復(fù)合因素處理的瘤苗較用單種藥物處理的瘤苗免疫原性強(qiáng)。而且用醛類(lèi)固定劑固定的瘤苗即可達(dá)到滅能、滅菌、防毒(病毒)和長(zhǎng)期保存(不必低溫凍存)的目的，其安全性及有效性也早已在有關(guān)生物制品的免疫學(xué)理論和防治實(shí)踐中獲得證明。該Ⅰ型瘤苗在制成后立即(或于臨用前)與CP混合成終濃度為3×106～7個(gè)瘤細(xì)胞/0.5mgCP/ml的混合瘤苗，可使非特異性與特異性主動(dòng)免疫結(jié)合起來(lái)，從而進(jìn)一步提高瘤苗的免疫抗癌效應(yīng)。制備細(xì)胞水平瘤苗的第二種工藝方法是先將腫瘤細(xì)胞懸液用病毒處理，其可以是紫外線(xiàn)滅能的痘苗病毒(UV-VV)按感染倍數(shù)(Moi)為10的比例，也可以是新城雞瘟病毒(NDV)按100～1000血凝單位(HU)/3×106～7瘤細(xì)胞的比例，于37℃、5%CO2下溫育4小時(shí)，洗滌后再分別與β欖香烯(或莪術(shù)油)(Ⅱ型)或β-欖香烯(或莪術(shù)油)+MMC(Ⅲ型)混合，其藥物濃度、處理?xiàng)l件及滅能固定、混合CP均與Ⅰ型瘤苗的制備方法相同。
本發(fā)明的方法具有如下優(yōu)點(diǎn)1.方法簡(jiǎn)單、可靠制備細(xì)胞水平腫瘤疫苗比分離提純TAA要簡(jiǎn)便、實(shí)用、可靠得多。
2.中草藥瘤苗為新的抗癌生物學(xué)制劑以抗癌中藥莪術(shù)及其有效成分β-欖香烯制備瘤苗在國(guó)內(nèi)外均屬首創(chuàng)。這類(lèi)以莪術(shù)油或β-欖香烯為主要成分的瘤苗比國(guó)外通常用放射能(X線(xiàn)、鈷60)照射制備瘤苗的主動(dòng)免疫效果好，且易于普及推廣。
3.可長(zhǎng)期保存本發(fā)明的瘤苗在一般條件下可有效地長(zhǎng)期保存，這就為自體瘤苗、異體瘤苗的應(yīng)用以至“瘤苗庫(kù)”設(shè)想的實(shí)現(xiàn)創(chuàng)造了條件。
4.使用安全本發(fā)明所制備的瘤苗是絕對(duì)滅能、滅菌(包括病毒、支原體)無(wú)毒的，使用十分安全，而且副作用也輕(局部、全身反應(yīng)都輕)易于為患者和臨床醫(yī)護(hù)人員接受。
5.免疫效能增強(qiáng)采用中藥(莪術(shù)油及β-欖香烯)化療藥(MMC)及/或病毒(VV或NDV)復(fù)合處理并與CP混合應(yīng)用，使瘤苗的免疫原性增強(qiáng)。因此本發(fā)明瘤苗的使用作為一種輔助療法將會(huì)產(chǎn)生予期的療效，特別是對(duì)于術(shù)后控制微小殘余瘤、防止轉(zhuǎn)移與復(fù)發(fā)爭(zhēng)取治愈更為理想，即使是對(duì)某些晚期腫瘤(包括轉(zhuǎn)移腫瘤)患者也會(huì)有一定的療效-延長(zhǎng)生命、減少?gòu)?fù)發(fā)、控制轉(zhuǎn)移、或提高生活質(zhì)量等。
例1在無(wú)菌及0～4℃條件下將手術(shù)切除的結(jié)腸癌塊(包括原發(fā)瘤及/或轉(zhuǎn)移瘤)去除包膜、結(jié)締組織、出血壞死組織后，剪成1mm3大小的碎塊，置50ml離心管中用適量磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌之后，以1000轉(zhuǎn)/分的速度離心8分鐘棄除上清液。向沉淀細(xì)胞中加入含0.14%胰酶，0.02%EDTA的Hanks緩沖鹽溶液(HBSS)30毫升置4℃冰箱過(guò)液。翌日取出置37℃水浴中搖床震蕩30分鐘，之后用200目不銹鋼網(wǎng)過(guò)濾，將濾液以1000轉(zhuǎn)/分離心8分鐘，再向沉積的細(xì)胞中加入0.03%DNA酶15ml，于37℃水浴搖床震蕩30分鐘后，以1000轉(zhuǎn)/分離心8分鐘，之后向沉淀細(xì)胞中加入155mM氯化銨緩沖液10ml，于室溫下作用10分鐘再加入磷酸鹽緩沖液(PBS)30ml，然后再以1000轉(zhuǎn)/分離心8分鐘，之后加入磷酸鹽(PBS)10ml計(jì)數(shù)腫瘤細(xì)胞數(shù)量，用臺(tái)盼蘭拒染法測(cè)活瘤細(xì)胞百分率大于70%。取上述10ml瘤細(xì)胞懸液加入100～200μg/ml的β欖香烯10ml和終濃度為100μg/ml的MMC于37℃溫育30～60分鐘，然后以1000轉(zhuǎn)/分離心8分鐘洗滌2次，向細(xì)胞沉淀加入0.0125%之戊二醛，再加入短小棒狀桿菌(CP)0.5mg/ml調(diào)整細(xì)胞數(shù)為1×107個(gè)/ml即可得到Ⅰ型混合瘤苗。將這些Ⅰ型混合瘤苗封裝于2ml的安瓿中1ml/支，(此前檢查瘤苗細(xì)胞形態(tài)、完整性并取材檢菌)，最后置于4℃冰箱中避光保存。該制備過(guò)程所得的外觀為無(wú)色半透明混懸液即為結(jié)腸癌Ⅰ型混合瘤苗。
例2重復(fù)實(shí)施例1中制備單個(gè)細(xì)胞懸液的操作，用RPMI1640培養(yǎng)液(含常規(guī)量慶大霉素、HEPES、NaHCO3、PH＝7.2～7.4)調(diào)整腫瘤細(xì)胞數(shù)至1×107～3×107個(gè)/ml移至培養(yǎng)平皿中，然后加入經(jīng)紫外線(xiàn)滅活的痘苗病毒，相當(dāng)于1×108～3×108個(gè)空斑形成單位(PFU)、感染倍數(shù)(Moi)為10，在37℃及5%CO2下溫育30分鐘且每隔15分鐘搖動(dòng)一次。之后加入人AB型血清使之最終濃度成為5%。然后再在37℃及5%CO2下繼續(xù)培養(yǎng)3.5小時(shí)且每隔30分鐘搖動(dòng)一次，之后以1000轉(zhuǎn)/分離心8分鐘，取細(xì)胞沉淀向內(nèi)加入100μg/ml的β-欖香烯10ml，然后在37℃溫育30～60分鐘，之后以1000轉(zhuǎn)/分離心8分鐘，取細(xì)胞沉淀向其內(nèi)加入0.0125%戊二醛和0.5mg/ml短小棒狀桿菌(CP)，調(diào)整細(xì)胞數(shù)為1×107個(gè)/ml，封裝入2ml的安瓶中1ml/支。(此前檢查瘤苗細(xì)胞形態(tài)完整性及并取材檢菌)，最后置于4℃冰箱避光保存，該制備過(guò)程所得的外觀為無(wú)色半透明混懸液即為結(jié)腸癌Ⅱ型痘苗病毒混合瘤苗。
例3重復(fù)實(shí)施例1中制備單個(gè)細(xì)胞懸液的操作。用RPMI1640培養(yǎng)液(含常規(guī)量慶大霉素、HEPES、NaHCO3、PH＝7.2～7.4)調(diào)整細(xì)胞濃度至1×107～3×107個(gè)/ml移至培養(yǎng)平皿中。然后加入新城雞瘟病毒1000血凝單位(HU)，在37℃及5%CO2下溫育30分鐘，每隔10分鐘輕輕搖勻一次。之后加入人AB型血清，使之最終濃度成為5%，然后再在37℃及5%CO2繼續(xù)培養(yǎng)3.5小時(shí)，每隔15～30分鐘輕輕搖勻一次，之后以1000轉(zhuǎn)/分離心8分鐘，取細(xì)胞沉淀向內(nèi)加入100μg/ml的β欖香烯10ml，以下步驟同例2，得到的產(chǎn)物為結(jié)腸癌Ⅱ型新城雞瘟病毒混合瘤苗。
例4重復(fù)例2的操作;至以1000轉(zhuǎn)/分離心8分鐘，取細(xì)胞沉淀向內(nèi)加入100μg/ml的β欖香烯10ml和100μg/ml的MMC10ml，然后在37℃溫育30～60分鐘，之后以1000轉(zhuǎn)/分離心8分鐘，重復(fù)操作2次。取細(xì)胞沉淀向其內(nèi)加入2%多聚甲醛和0.5mg/ml短小棒狀桿菌(CP)調(diào)整細(xì)胞數(shù)為1×107/ml，然后用前述例中的方法包裝、存放、所得產(chǎn)物即為Ⅲ型痘苗病毒混合瘤苗。
例5重復(fù)例3的操作至以1000轉(zhuǎn)/分離心8分鐘，取細(xì)胞沉淀向內(nèi)加入100μg/ml的β欖香烯10ml和100μg/mlMMC 10ml，然后在37℃溫育30～60分鐘，之后以1000轉(zhuǎn)/分離心8分鐘，重復(fù)操作2次。取細(xì)胞沉淀向其內(nèi)加入0.0125%戊二醛和0.5mg/ml短小棒狀桿菌(CP)調(diào)整細(xì)胞數(shù)為1×107/ml，然后用前述例中的方法包裝、存放、所得產(chǎn)物即為Ⅲ型新城雞瘟病毒混合瘤苗。
表2各種瘤苗對(duì)L615的免疫保護(hù)效應(yīng)。
處理方法動(dòng)物數(shù)存活率%死亡動(dòng)物的存活時(shí)間(X±SD)天莪術(shù)油2070.026.2±15.6**β-欖香烯1478.611.9±2.6MMC1573.443.0±13.7**CP和瘤細(xì)胞混合2060.033.0±20.8**戊二醛1040.09.7±0.560Co照射 30 33.3 18.0±13.6*熱滅活10010.69±0.5無(wú)細(xì)胞提取液10010.1±4.2超聲波瘤勻漿1009.9±0.5各對(duì)照組45010.6±1.5＊＊P＜0.01＊P＜0.05均與對(duì)照組比上表顯示本發(fā)明的莪術(shù)、β欖香烯瘤苗及CP和瘤細(xì)胞混合瘤苗等均顯著優(yōu)于傳統(tǒng)60Co照射瘤苗。
表3單因素和多因素處理的腫瘤細(xì)胞(L615)的免疫保護(hù)效應(yīng)比較表處理因素存活率(%)MST±SD(天)β-欖香烯66.713.5±1.5MMC8014.0±0.0戊二醛4214.5±1.3β-欖香烯+戊二醛71.317.5±0.7β-欖香烯+MMC87.515.5±0.7β-欖香烯+MMC+戊二醛88.920.0±4.2對(duì)照組09.5±0.6上表顯示β欖香烯、MMC、戊二醛復(fù)合處理免疫效果更佳。
表4痘苗病毒和β-欖香烯處理瘤苗的免疫保護(hù)效應(yīng)比較表(MH134肝癌)組別存活率(%)死亡動(dòng)物平均存活時(shí)間(天)β-欖香烯瘤苗42.915.5VV+β欖香烯瘤苗85.719對(duì)照組017.5
表5本發(fā)明方法與現(xiàn)有技術(shù)比較表現(xiàn)有技術(shù)本發(fā)明方法優(yōu)點(diǎn)瘤單因素處理復(fù)合因素處理1)用抗癌中藥及其有效苗1)放射線(xiàn)(X線(xiàn)、鈷60)1)莪術(shù)油或其有效成分成分制備瘤苗均屬首創(chuàng)制2)絲裂霉素C(MMC)β-欖香烯+MMC2)莪術(shù)油或β-欖香烯瘤備3)病毒(感染的腫瘤細(xì)2)病毒(VV或NDV)+苗的保護(hù)效應(yīng)高于經(jīng)典胞或病毒溶瘤物)β-欖香烯(或OCA)法鈷60照射瘤苗,存活4)分離提純的腫瘤相3)病毒(VV或NDV)+β率分別為70～80%與30關(guān)抗原-欖香烯(或OCA)+MMC～40%3)復(fù)合處理方法其療效更優(yōu)于單因素處理.
瘤液氮凍存活細(xì)胞用時(shí)采用醛類(lèi)固定劑既可充分滅能保證安全苗復(fù)蘇(有時(shí)還需經(jīng)培養(yǎng)又可長(zhǎng)期保存保擴(kuò)增達(dá)到一定數(shù)量時(shí)存才能重新制備瘤苗)使用結(jié)核桿菌(BCG)或精短小棒狀桿菌(CP)1)CP為死菌苗安全、時(shí)所制蛋白衍生物(結(jié)核死菌苗在制備瘤苗有效、方便.
用佐菌素PPD)與瘤苗免時(shí)同時(shí)加入成混合2)本發(fā)明將瘤苗制備、劑疫注射時(shí)并用瘤苗保存及佐劑使用在一個(gè)流程內(nèi)解決,可在普通條件下長(zhǎng)期保存?zhèn)溆?
表6本發(fā)明中瘤苗的保存方法與現(xiàn)有技術(shù)比較表比較項(xiàng)目本發(fā)明方法現(xiàn)有方法基本方法采用醛類(lèi)固定劑用液氮冷凍達(dá)到的效能保證達(dá)到滅能(瘤細(xì)胞是死是活瘤細(xì)胞凍存應(yīng)用的)滅菌、防毒(病毒)而保時(shí)需復(fù)蘇重新制備瘤苗存其增高的免疫原性(實(shí)際上不是瘤苗的保存)操作手續(xù)在制備瘤苗的流程中凍存要加二甲基亞砜、一次解決,十分簡(jiǎn)便人血清白蛋白,最好有專(zhuān)門(mén)的液氮冷凍溫控儀,保存期要向液氮罐內(nèi)定期加液氮復(fù)蘇后還要立即將二甲基亞砜洗去.
費(fèi)用只需少量固定劑成本要有專(zhuān)門(mén)設(shè)備、長(zhǎng)期十分低廉(<0.1元/支)消耗液氮和冷凍用制劑安全性絕對(duì)安全冷凍、復(fù)蘇及瘤苗制(>50元/支)備過(guò)程仍要注意操作的安全性.
可靠性一般置4℃就可保存如液氮凍存一般可保存置-20℃以上的低溫冰一年以上,但復(fù)蘇成箱可長(zhǎng)期保存功率不一定是100%.
推廣、應(yīng)用保存運(yùn)輸均極為方便使不便于保存、運(yùn)輸與開(kāi)發(fā)自體瘤苗、異體瘤苗以不易推廣、開(kāi)發(fā)至建立"瘤苗庫(kù)"均可實(shí)現(xiàn).
注本發(fā)明中，除特殊標(biāo)明的之外均為重量百分比。
權(quán)利要求
1.一種腫瘤疫苗的制備方法，其先要制備單個(gè)瘤細(xì)胞懸液，即將腫瘤組織制成1mm3的小塊，洗滌后依次用胰酶(0.14%)、DNA酶(0.03%)消化，置4℃8～16小時(shí)，再經(jīng)搖床震蕩30分鐘，然后用200目不銹鋼網(wǎng)過(guò)濾，濾液被離心洗滌之后用氯化銨緩沖液處理，可得到單個(gè)瘤細(xì)胞懸液，其特征在于細(xì)胞水平瘤苗的制備如下Ⅰ型瘤苗將上述單個(gè)瘤細(xì)胞懸液與等體積的200～400μg/ml的莪術(shù)油或100～200μg/ml的β-欖香烯及終濃度為50～100μg/ml的MMC處理60～120分鐘，離心洗滌后加入醛類(lèi)固定劑，再與短小棒狀桿菌(CP)混合成為混合瘤苗，或Ⅱ型瘤苗向上述單個(gè)瘤細(xì)胞懸液加入新城雞瘟病毒(NDV)按100--1000血凝單位(HU)/3×106～7瘤細(xì)胞或者用紫外線(xiàn)滅能的痘苗病毒(UV--VV)按感染倍數(shù)(Moi)為10的比例處理，于37℃5%CO2下溫育4小時(shí)，離心洗滌后再分別與等體積的200～400μg/ml莪術(shù)油或100～200μg/mlβ-欖香烯混合，再于37℃溫育30～60分鐘，離心后向細(xì)胞沉淀加入醛類(lèi)固定劑并與CP混合，或Ⅲ型瘤苗向上述單個(gè)瘤細(xì)胞懸液加入新城雞瘟病毒(NDV)按100～1000血凝單位(HU)/3×106～7瘤細(xì)胞或者用紫外線(xiàn)滅能的痘苗病毒(UV--VV)按感染倍數(shù)(Moi)為10的比例處理，于37℃、5%CO2下溫育4小時(shí)，離心洗滌后再分別與等體積的200～400μg/ml莪術(shù)油+MMC或100～200μg/mlβ-欖香烯+MMC混合，再于37溫育30～60分鐘，離心后向細(xì)胞沉淀加入醛類(lèi)固定劑并與CP混合。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的腫瘤疫苗的制備方法，其特征在于醛類(lèi)固定劑為0.0125%的戊二醛。
全文摘要
一種腫瘤疫苗的制備方法，其先采用常規(guī)方法制成單個(gè)瘤細(xì)胞懸液，將它用β-欖香烯(或莪術(shù)油)和MMC處理，然后加入醛類(lèi)固定劑并與CP混成I型瘤苗?；?qū)蝹€(gè)瘤細(xì)胞懸液用病毒處理，其可以是紫外線(xiàn)滅能的痘苗病毒也可以是新城雞瘟病毒，它們?cè)俜謩e與β-欖香烯(或莪術(shù)油)或β-欖香烯(或莪術(shù)油)+MMC混合，再加入醛類(lèi)固定劑并與CP混合分別得到II型和III型瘤苗。本發(fā)明的方法制備的腫瘤疫苗滅能徹底、保存方便、療效高。
文檔編號(hào)A61K39/00GK1097142SQ93112060
公開(kāi)日1995年1月11日 申請(qǐng)日期1993年7月5日 優(yōu)先權(quán)日1993年7月5日
發(fā)明者錢(qián)振超, 王大慶, 劉金友, 魏文漢, 金成剛 申請(qǐng)人:大連醫(yī)學(xué)院