專利名稱：紫地榆有效部位的制備及其防治結(jié)腸炎的藥物用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體而言，本發(fā)明涉及一種紫地榆有效部位及其制備方法和藥物用途。該有效部位由云 南民間白族/彝族常用草藥隔山消經(jīng)現(xiàn)代提取エ藝制備而成，具有明顯的抗?jié)冃越Y(jié)腸炎功效，可以用于制備防治潰瘍性結(jié)腸炎的保健品或藥物。
背景技術(shù)：
潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis, UC)是ー種病因尚未確定的、主要累及直腸、結(jié)腸黏膜層及黏膜下層的慢性非特異性腸道炎癥性疾病，臨床上以腹瀉、腹痛、黏液膿血便和里急后重等為主要癥狀，以結(jié)腸黏膜慢性炎癥和潰瘍形成為主要病理特點(diǎn)。一般認(rèn)為UC的發(fā)病與自身免疫、感染、遺傳、精神及環(huán)境因素等有夫。目前國(guó)內(nèi)外尚未找到特異性治療藥物和方法，臨床上治療常用的幾類藥物(氨基水楊酸類、皮質(zhì)類固醇激素、免疫抑制劑等)都只是緩解其臨床癥狀，且存在停藥后易復(fù)發(fā)和長(zhǎng)期使用不良反應(yīng)多等缺點(diǎn)。由于該病治愈難度大、易復(fù)發(fā)，并與結(jié)腸癌的發(fā)病存在一定的關(guān)系，被世界衛(wèi)生組織列為現(xiàn)代難治病之一。由于該病自然病程的復(fù)雜特殊及對(duì)患者生活質(zhì)量的嚴(yán)重影響，UC的治療現(xiàn)已成為消化系統(tǒng)疾病中的難點(diǎn)，日益受到關(guān)注。而有跡象表明，我國(guó)UC的發(fā)生率正逐年增高。因此，尋找其它療效顯著且副作用小的藥物以替代目前的常規(guī)藥物己成為全世界研究的熱點(diǎn)和主要方向。由于潰瘍性結(jié)腸炎與自身免疫有關(guān)，因此在治療該疾病時(shí)常規(guī)方法為選用糖皮質(zhì)激素(例如，強(qiáng)的松、地塞米松、甲基強(qiáng)的松龍)或免疫抑制劑。而長(zhǎng)期服用激素類制劑和免疫抑制劑的副作用都很大，使這些本來(lái)就受疾病折磨的患者猶如雪上加霜。尤其是大劑量激素的沖擊療法及激素長(zhǎng)期的維持治療，激素的毒副作用也隨之明顯凸現(xiàn)，比如會(huì)出現(xiàn)類腎上腺皮質(zhì)功能亢進(jìn)現(xiàn)象向心性肥胖、面色潮紅、甚至動(dòng)則汗出或入夜盜汗、痤瘡等，且病人容易繼發(fā)感染或加重感染，機(jī)體的生長(zhǎng)發(fā)育延緩等等。而免疫抑制劑又會(huì)出現(xiàn)骨髄抑制，可能發(fā)生粒細(xì)胞減少；肝功能損害，使谷丙轉(zhuǎn)氨酶(SGPT或ALT)增高；性機(jī)能損害，尤其是男性，少數(shù)可發(fā)生不育；脫發(fā)；出血性膀肌炎，血尿增多；抵抗力降低；惡心、嘔吐、食欲不振等胃腸道反應(yīng)。服用激素或免疫抑制最大的缺點(diǎn)是停藥后都容易復(fù)發(fā)。由于西藥治療潰瘍性結(jié)腸炎有很多的缺點(diǎn)，如上述治療的不徹底、易復(fù)發(fā)、對(duì)機(jī)體的傷害較大等；而中草藥在疾病，尤其是慢性難治性頑疾的治療上有著獨(dú)特的療效。因此，中草藥治療潰瘍性結(jié)腸炎越來(lái)越被患者所接受。由于潰瘍性結(jié)腸炎經(jīng)常有腹瀉、粘液便和膿血便、里急后重、腹痛、發(fā)熱等癥狀，中醫(yī)認(rèn)為是濕熱郁結(jié)，余邪不盡、熱毒結(jié)聚等癥狀，故在中藥的辯證方藥上使用清熱、燥濕、活血及解毒的中草藥。然而，常用的治療潰瘍性結(jié)腸炎中藥都是數(shù)種中草藥組成的復(fù)方，不僅藥物質(zhì)量控制不易，服用上也不方便。因此，以單味中草藥為基礎(chǔ)，富集其有效組分或有效部位，將其開發(fā)成為安全、有效、可控的現(xiàn)代中藥/天然藥物是當(dāng)前藥物研發(fā)的研究熱點(diǎn)。紫地榆(Geranium strictipes R. Knuth )為物牛兒苗科老鸛草屬植物,是中國(guó)的特有植物，分布在中國(guó)大陸的云南、四川等地。紫地榆生長(zhǎng)于海拔2，700米至3，000米的地區(qū)，常生于山坡草地、林下及灌叢，目前尚未由人工引種栽培。在云南主要分布于中甸、麗江、大理、昆明等地；其根為白族、彝族民間常用草藥隔山消，味苦、微澀、酸，性微寒，功能主治為清熱利濕，活血止血(滇南本草)。白族和彝族民間多用于治療厭食、痢疾、慢性胃炎、脘腹疼痛，月經(jīng)不調(diào)，鼻衄；也可外用，治跌打損傷。國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)表明目前對(duì)紫地榆的研究主要集中在對(duì)其化學(xué)成以及隔山消(紫地榆的根)水提物抑齲作用方面的探索，而對(duì)該藥的有關(guān)藥理、毒理、臨床應(yīng)用、藥材標(biāo)準(zhǔn)等方面的研究報(bào)道都非常少。已報(bào)道的紫地榆主要化學(xué)成分包括鞣質(zhì)類和酚酸類，其中五倍子酸甲酯具有抗HIV的活性。除本專利發(fā)明人前期對(duì)其粗提物的抗菌作用進(jìn)行了初歩研究，尚未見其它關(guān)于紫地榆和/或其有效部位用于防治潰瘍性結(jié)腸炎的報(bào)道。隔山消( 紫地榆的干燥根)是云南民間白族、彝族常用中草藥，雖然當(dāng)?shù)鼐用褚矊⑵鋺?yīng)用于治療慢性胃炎等消化道疾病。但是，還未有特別應(yīng)用于治療潰瘍性結(jié)腸炎的報(bào)道。此外，由于隔山消味苦，需長(zhǎng)期服藥的慢性難治性疾病如潰瘍性結(jié)腸炎患者，一般很難按吋、按量長(zhǎng)期服用常規(guī)煎煮的藥物。并且隔山消中含有大量鞣質(zhì)，因此，其在治療慢性疾患的同時(shí)可能對(duì)胃黏膜造成新的刺激與傷害。為了去蕪存菁，即保留紫地榆藥材中防治潰瘍性結(jié)腸炎的有效部位、去除易產(chǎn)生毒副作用的成分，使患者不需服用大量藥物即可達(dá)到防治效果，我們對(duì)紫地榆的有效部位提取エ藝進(jìn)行了大量研究，并以こ酸所致大鼠潰瘍性結(jié)腸炎為藥效試驗(yàn)?zāi)Ｐ?，?yàn)證紫地榆有效部位用于治療潰瘍性結(jié)腸炎的功效。據(jù)此完成本發(fā)明。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種適合于エ業(yè)化生產(chǎn)的紫地榆有效部位，具體而言，該有效部位由下列方法制備得到a)用50%_90%こ醇溶劑回流提取經(jīng)粉碎的紫地榆3次，每次提取1-10小時(shí)，溫度50-800C ;合并提取液，減壓濃縮得こ醇浸膏；b)將步驟a得到的こ醇浸膏溶于蒸餾水中超聲使其充分溶解，經(jīng)大孔吸附樹脂材料柱層析，水洗，然后用60%的こ醇-水洗脫，其中大孔吸附樹脂的型號(hào)為AB-8 ；c)將步驟b得到的洗脫液減壓濃縮至無(wú)醇味，冷凍干燥得產(chǎn)品。其中，減壓濃縮時(shí)的溫度不超過(guò)100°C ;步驟a中的提取時(shí)間優(yōu)選2-6小吋。本發(fā)明中的紫地榆是指物牛兒苗科老鸛草屬植物紫地榆Geranium strictipesR. Knuth的任一部位或全草,優(yōu)選其干燥根。本發(fā)明的另一目的是提供了由大孔樹脂制備得到的紫地榆有效部位在制備治療潰瘍性結(jié)腸炎的藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明的再一目的是提供ー種具有防治潰瘍性結(jié)腸炎功能的藥物，該藥物含有治療有效量的紫地榆有效部位提取物、藥用輔料和可藥用載體。以紫地榆有效部位為原料的藥物制劑可以是注射劑、片劑、顆粒劑、膠囊劑、ロ服液、氣霧劑、透皮貼劑、栓劑、滴丸劑、夕卜用搽劑、軟膏劑等劑型藥物。本發(fā)明的相關(guān)試驗(yàn)中選用了 AB-8大孔吸附樹脂為分離工具，有效地富集了紫地榆有效部位；并采用10%こ酸復(fù)制大鼠潰瘍性結(jié)腸炎模型(UC大鼠)，觀察UC大鼠體重變化、大便隱血情況；檢測(cè)UC大鼠腸道結(jié)腸黏膜組織損傷情況以及病理組織學(xué)變化；測(cè)定UC大鼠結(jié)腸組織中丙ニ醛(MDA)含量、超氧化物歧化酶(SOD)活性、NO自由基含量、髓過(guò)氧化物酶(MPO)活性和谷胱甘肽-過(guò)氧化物酶(GSH-PX)含量；摘取UC大鼠脾臟、胸腺和結(jié)腸，計(jì)算脾臟指數(shù)、胸腺指數(shù)、結(jié)腸濕重指數(shù)等。エ藝研究及藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明使用大孔吸附樹脂對(duì)紫地榆醇提物進(jìn)行精制在生產(chǎn)エ藝上及其在制備防治UC的制藥用途的應(yīng)用上有著相當(dāng)?shù)膬?yōu)勢(shì)，并且以往未見相關(guān)的報(bào)道，從而構(gòu)成本發(fā)明。本發(fā)明有益之處在于首次發(fā)現(xiàn)由AB-8大孔樹脂制備的紫地榆有效部位具有防治潰瘍性結(jié)腸炎方面的成藥潛力，為開發(fā)防治該疾病創(chuàng)新性非激素藥物或免疫抑制劑提供了新的物質(zhì)基礎(chǔ)。具有潛在巨大的社會(huì)效益和經(jīng)濟(jì)效益。本發(fā)明再一特點(diǎn)為紫地榆有效部位的制備采用了除去干擾成分效果好、操作簡(jiǎn)便、樣品損耗小、成本低、污染小、安全可靠的大孔吸附樹脂為提取分離材料，利于節(jié)能減排條件下的大規(guī)模生產(chǎn)。產(chǎn)業(yè)化前景十 分明確。
具體實(shí)施例方式為了更好地理解本發(fā)明的實(shí)質(zhì)，下面通過(guò)實(shí)施例進(jìn)ー步說(shuō)明本發(fā)明。實(shí)施例給出了紫地榆有效部位的制備及其對(duì)大鼠こ酸所致潰瘍性結(jié)腸炎的治療效果，說(shuō)明其在制備防治潰瘍性結(jié)腸炎中的用途。必須說(shuō)明，本發(fā)明的實(shí)施例是用于說(shuō)明本發(fā)明而不是對(duì)本發(fā)明的限制。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)質(zhì)對(duì)本發(fā)明進(jìn)行的簡(jiǎn)單改進(jìn)都屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。實(shí)施例I :紫地榆有效部位(樣品I)的制備I. I儀器與試劑FD-1C-80冷凍干燥機(jī)為北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司產(chǎn)品，超凈工作臺(tái)采用蘇州凈化設(shè)備有限公司SW-CJ-2FD型雙人單面凈化工作臺(tái)，隔水式恒溫培養(yǎng)箱為上海一恒科技有限公司產(chǎn)品，滅菌鍋用上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠YXQ-LS-50SII型立式壓カ蒸汽滅菌器，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(R-210)為瑞士步祺產(chǎn)品，臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(TL-16R型)為上海離心機(jī)機(jī)械研究所產(chǎn)品，紫外分光光度計(jì)(722型)購(gòu)自上海第三分析儀器廠。紫外光譜用Shimadzu UV-240紫外分光光度計(jì)測(cè)定，薄層制備層析(PTLC)用Merck公司的鋁箔硅膠板，薄板(TLC)檢測(cè)用254nm和365nm的紫外燈；顯色劑用碘蒸氣、10%硫酸-こ醇以及磷鑰酸溶液。こ酸、こ醇、甲醇等試劑均為分析純，天津化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn)。I. 2 藥材隔山消，購(gòu)自大理集盛大藥房。經(jīng)大理學(xué)院藥學(xué)與化學(xué)學(xué)院馬曉匡教授鑒定為物牛兒苗科老鸛草屬植物紫地榆Geranium strictipes R. Knuth的干燥根。I. 3紫地榆こ醇浸膏的制備取隔山消藥材(紫地榆的干燥根)5公斤，粉碎后加60%こ醇10000毫升浸泡，加溫至60°C提取，提取3次，毎次本別為2小吋、4小吋、4小吋。合并提取液，減壓濃縮得紫地榆こ醇浸膏(粗提物I) I. 64公斤，即I克浸膏相當(dāng)于3. 06克生藥。I. 4紫地榆有效部位提取物的制備將I. 3項(xiàng)下制備得到的粗提物I (500克)溶于3750毫升蒸餾水中超聲使其充分溶解，用750克大孔吸附樹脂AB-8吸附拌樣，上柱，先用水洗脫至無(wú)色。續(xù)用60%こ醇-水溶液洗脫至無(wú)色，取洗脫液500毫升減壓濃縮至干，真空干燥，即得紫地榆有效部位(樣品I)。
實(shí)施例2 :紫地榆有效部位(樣品II)的制備2. I儀器與試劑同實(shí)施例I。2. 2藥材同實(shí)施例I。2. 3紫地榆こ醇浸膏的制備取隔山消藥材(紫地榆的干燥根)5公斤，加60%こ醇10000毫升浸泡，加溫至60°C提取，提取3次，毎次本別為4小吋、6小吋、8小吋。合并提取液，減壓濃縮得紫地榆こ醇浸膏(粗提物II) I. 63公斤，即I克浸膏 相當(dāng)于3. 06克生藥。2. 4紫地榆有效部位提取物的制備將2. 3項(xiàng)下制備得到的粗提物II (500克)溶于3750毫升蒸餾水中超聲使其充分溶解，用750克大孔吸附樹脂AB-8吸附拌樣，上柱，先用水洗脫至無(wú)色。續(xù)用60%こ醇-水溶液洗脫至無(wú)色，取洗脫液500毫升減壓濃縮至干，真空干燥，即得紫地榆有效部位(樣品
II)。實(shí)施例3 :紫地榆有效部位對(duì)こ酸所致潰瘍性結(jié)腸炎大鼠隱血的影響3. I實(shí)驗(yàn)材料3. I. I動(dòng)物SD雄性大鼠，體重為220 240克，合格證號(hào)SCXK (滇)2005-0008，昆明醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。大鼠飼料及墊料由大理學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。3. I. 2受試藥物粗提物I，即實(shí)施例I制備得到的紫地榆こ醇浸膏；樣品I，即實(shí)施例I制備得到的紫地榆有效部位。實(shí)驗(yàn)以柳氮磺胺吡啶(SASP，上海信誼嘉華藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，批號(hào)100527)為陽(yáng)性對(duì)照品，用時(shí)用刀片刮去黃色糖衣，呈現(xiàn)黃褐色，研碎后過(guò)100目篩，用O. 5%CMC-Na配制成劑量為300毫克/公斤的混懸液備用。3. I. 3 試劑冰こ酸(天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司，批號(hào)080308，分析純)；以下試劑盒由南京建成生物工程研究所提供隱血(OB)試劑盒，批號(hào)20101126 ；考馬斯亮藍(lán)蛋白試劑盒，批號(hào)20100925 ;丙ニ醛(MDA)試劑盒，批號(hào)20101124 ;S0D試劑盒(測(cè)總)，批號(hào)=20101125 ;一氧化氮測(cè)試盒(硝酸還原酶法)，批號(hào):20101117 ;髓過(guò)氧化物酶(MPO)測(cè)試盒，批號(hào)20101109 ;谷胱甘肽-過(guò)氧化物酶(GSH-PX)測(cè)試盒，批號(hào)20101116。3. I. 4主要儀器同實(shí)施例I。3. 2試驗(yàn)方法3. 2. Iこ酸性潰瘍性結(jié)腸炎(UC)大鼠造模大鼠在實(shí)驗(yàn)室常規(guī)飼養(yǎng)一周。實(shí)驗(yàn)前禁食不禁水24小吋，記錄體重。造模前先用5%肥皂水灌腸，清潔腸道。30分鐘后用こ醚麻酔，經(jīng)肛門插入直徑3毫米的聚こ烯纖維導(dǎo)管8 10公分，取仰臥位，注入10%こ酸溶液I. 5毫升、保留15秒，立即用3 5毫升生理鹽水(NS)沖洗兩次。造模24小時(shí)后大鼠即出現(xiàn)腹瀉，為黃色稀便、半稀便甚至血便，體重下降，精神萎靡，自主活動(dòng)減少。其糞便性狀及一般情況的改變，符合實(shí)驗(yàn)性UC的改變，表明造模成功。3. 2. 2分組及給藥造模24小時(shí)后，大鼠隨機(jī)分為9組，即樣品1(50毫克/公斤、100毫克/公斤、200毫克/公斤)、粗提物I (低、中、高劑量組)、陽(yáng)性對(duì)照SASP組、模型組、正常對(duì)照組，每組10只。其中，正常組大鼠用生理鹽水按3. 2. I造模方法處理。造模后24小時(shí)開始灌胃給藥，I次/天，連續(xù)7天。正常組和模型組以等容量的生理鹽水灌胃；粗提物I用O. 5%羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)配制成低、中、高劑量(163. 4毫克/公斤、326. 8毫克/公斤、653. 6毫克/公斤，相當(dāng)于O. 5、I. 0、2克生藥/公斤)。3. 2. 3大便隱血實(shí)驗(yàn)采用鄰聯(lián)甲苯胺法，用隱血(OB)試劑盒檢測(cè)，用棉簽挑取少量大鼠大便于白瓷板上，先滴加鄰聯(lián)甲苯胺，再滴加過(guò)氧化氫，根據(jù)顯色時(shí)間和顯色程度進(jìn)行隱血等級(jí)評(píng)分。隱血等級(jí)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)如下 __典便表現(xiàn)_
0陰性(_) (3分鐘后不顯藍(lán)綠色)
1隠血(+ ) (30 60秒中內(nèi)、1i藍(lán)色)
2隱血(++)(立_顯藍(lán)綠色)
3隱血(+++)(立即顯深藍(lán)色)
_4_肉眼血便_3. 2. 4數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析統(tǒng)計(jì)軟件為SPSS16. O,結(jié)果用均數(shù)土標(biāo)準(zhǔn)差表示，各組總體比較采用單因素方差分析，組間比較采用t檢驗(yàn)，涉及的計(jì)量資料采用秩和檢驗(yàn)，P
<O. 05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。3. 3實(shí)驗(yàn)結(jié)果こ酸性UC大鼠造模后，對(duì)各組造模24小時(shí)和給藥7天后的隱血情況進(jìn)行評(píng)價(jià)與統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，紫地榆有效部位對(duì)UC大鼠隱血的影響的實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1-2。造模24小時(shí)后各組大鼠大便隱血情況沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，隱血大部分呈陽(yáng)性(++)或強(qiáng)陽(yáng)性(+++)。經(jīng)藥物治療后，隱血程度逐漸減輕。給藥7天后，各組間隱血情況比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P〈0. 001)。除正常組外，各組造模后24小時(shí)和給藥7d后的隱血情況之前后比較P < O. 05，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，其中粗提物組和樣品I之高、中、低劑量組給藥前后都有非常顯著的差異(P〈0. 01 )。表I.紫地榆有效部位對(duì)こ酸所致UC大鼠隱血的影響(造模后24小吋)
權(quán)利要求
1.一種紫地榆有效部位提取物，其特征由下列方法制備得到 a)用50%-90%こ醇溶劑回流提取經(jīng)粉碎的紫地榆3次，每次提取1-10小吋，溫度50-800C ;合并提取液，減壓濃縮得こ醇浸膏； b)將步驟a得到的こ醇浸膏溶于蒸餾水中超聲使其充分溶解，經(jīng)大孔吸附樹脂材料柱層析，水洗，然后用60%的こ醇-水洗脫，其中大孔吸附樹脂的型號(hào)為AB-8 ； c)將步驟b得到的洗脫液減壓濃縮至無(wú)醇味，冷凍干燥得產(chǎn)品。
2.根據(jù)權(quán)利要求I的紫地榆有效部位提取物，其特征為紫地榆是指櫳牛兒苗科老鸛草屬植物紫地榆Geranium strictipes R. Knuth的干燥根；減壓濃縮時(shí)的溫度不超過(guò)IOO0C ;步驟a中的提取時(shí)間為2-6小時(shí)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1-2之一的紫地榆有效部位提取物用于制備防治潰瘍性結(jié)腸炎的藥物用途。
4.ー種具有防治潰瘍性結(jié)腸炎功能的藥物，其為治療有效量的根據(jù)權(quán)利要求1-2之一的紫地榆有效部位提取物、藥用輔料和可藥用載體。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的藥物，其藥物劑型是片劑、顆粒劑、膠囊、ロ服液、注射劑、滴丸、氣霧劑、透皮貼劑、栓劑、外用搽劑或軟膏劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及紫地榆有效部位的制備及其防治結(jié)腸炎的藥物用途。本發(fā)明的紫地榆有效部位提取物由彝藥隔山消經(jīng)大孔吸附樹脂精制而成。隔山消為牻牛兒苗科老鸛草屬植物紫地榆Geranium strictipes R.Knuth的干燥根。本發(fā)明采用大鼠乙酸所致潰瘍性結(jié)腸炎模型，觀察紫地榆有效部位對(duì)模型大鼠的一般臨床癥狀、病理形態(tài)學(xué)和氧化損傷的相關(guān)生化指標(biāo)的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，紫地榆有效部位對(duì)乙酸所致潰瘍性結(jié)腸炎大鼠模型具有一定的治療作用，可改善其臨床癥狀。因此，紫地榆有效部位可以預(yù)期應(yīng)用于制備防治潰瘍性結(jié)腸炎的藥物。
文檔編號(hào)A61K36/185GK102688263SQ20121017912
公開日2012年9月26日 申請(qǐng)日期2012年6月2日 優(yōu)先權(quán)日2012年6月2日
發(fā)明者張嫻文, 施貴榮, 李鳳賢, 李輝, 洪小鳳, 耿玲, 趙昱 申請(qǐng)人:大理學(xué)院