專利名稱：脫氫表雄酮組合治療方法
發(fā)明概述本發(fā)明提供了通過增強(qiáng)或消減白細(xì)胞介素12和/或白細(xì)胞介素10的合成或效率用于恢復(fù)白細(xì)胞介素12(IL-12)和/或白細(xì)胞介素10(IL-10)的正常水平的化合物組合治療法。
在本發(fā)明的一個方面，本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)如美國專利號4,956,355(Prendergast)公開，當(dāng)用于與抑制白細(xì)胞介素10的合成和/或作用的藥劑一起組合治療時具有其它有益的治療效果的抗病毒藥劑(本文中的通式)。當(dāng)用于本文所述的篩選方案(篩選IL-10)時可以通過鑒定除了已證實抑制白細(xì)胞介素10的藥劑外具有抑制環(huán)狀A(yù)MP活性能力的化合物可以鑒定抑制白細(xì)胞介素10的藥劑。采用各種各樣的化合物，包括下面的化合物-硫酸刀豆氨酸，L-硫酸刀豆氨酸，Heroimycin A(Wako Pure化學(xué)有限公司，日本)，染料木因(希格瑪化學(xué)公司，圣路易斯，美國)，黑麥酮酸D，異黃素類化合物，細(xì)胞激動素，兩親性三萜類或上面這些的類似物和白細(xì)胞介素10或它的任何一種肽序列的多克隆或單克隆抗血清合在一起的任何一種或其組合可以抑制白細(xì)胞介素10的合成。
抗病毒藥劑是具有通式(1)的17-酮甾類的化合物
其中R是氫原子，R1是化學(xué)基團(tuán)，該基團(tuán)選自于由氫原子，SO2OM基團(tuán)(其中M選自由氫原子，鈉原子的基團(tuán)組成的組)，硫脂基團(tuán)組成的組
其中，R2和R3可以是相同或不同，他們各選自由1到14個碳原子的直鏈和支鏈烷基的基團(tuán)，磷脂基團(tuán)組成的組
其中R2和R3可以相同或不同，它們各自選自由1到14個碳原子的直鏈和支鏈烷基的基團(tuán)，和葡糖苷酸基團(tuán)組成的組
其中間斷線代表旋光雙鍵，第5位的氫原子有α-或β-構(gòu)型，或者該化合物包括兩種構(gòu)型的混合物。當(dāng)R1不是氫原子時，該化合物是共軛化合物。
在本發(fā)明的另一方面，提供了當(dāng)使用一個或多個17-甾酮化合物作為抗病毒，抗細(xì)菌，抗菌質(zhì)或抗細(xì)胞內(nèi)寄生蟲藥劑時，增強(qiáng)Th1免疫保護(hù)應(yīng)答的方法，該方法將該藥劑與白細(xì)胞介素10(細(xì)胞因子抑制因子)的多或單克隆抗血清和/或與任何化合物結(jié)合，該化合物可以有效抑制該特異細(xì)胞因子白細(xì)胞介素10和/或白細(xì)胞介素10(細(xì)胞因子抑制因子)受體分子封阻試劑的合成或生物功能。
例如，需要抗癌，抗病毒，抗轉(zhuǎn)移，抗多種藥物抗性癌細(xì)胞和/或細(xì)菌，非抗性細(xì)菌感染治療的病人需要Th1免疫保護(hù)應(yīng)答。
本發(fā)明同時涉及在制造藥劑時使用這樣的化合物用于提供任何這樣的治療。
本發(fā)明的藥物配方可以局部地或全身地給藥。全身給藥是指導(dǎo)致在血液或離所述活性成分的給藥位點遙遠(yuǎn)的位點中出現(xiàn)有效水平的活性成分的任何給藥方式或途徑。
本發(fā)明的用于全身給藥的藥物配方可以配制為用于腸道的，非腸胃的或局部的給藥。事實上，所有三種類型的配方可以同時使用以便達(dá)到該活性成份的全身給藥。
合適的口服給藥配方包括硬的或軟的明膠膠囊，糖衣藥丸，丸劑，片劑，包括包衣片劑，甘香酒劑，懸浮液，糖漿或吸入劑和它們的控制釋放形式。
除了為口服給藥配制的形式，固體劑量形式包括直腸栓劑。
合適的用于局部給藥的配方包括奶液，凝膠，凍膠，膠漿，糊劑和軟膏。為了達(dá)到全身地給藥，透皮給藥的這些化合物也可以配制為例如，透皮膏藥的形式。
合適的可注射溶液包括靜脈內(nèi)，皮下和肌肉內(nèi)注射溶液。這些化合物也可以以輸注溶液的形式或作為鼻吸入劑或噴劑形式給藥。
本發(fā)明的藥物配方可以以含有10-1000毫克的活性成分的單位劑量給藥。優(yōu)選地，每單位劑量含有各50-500毫克的各個活性成分。本發(fā)明的各藥物配方至少含有兩個活性成分。
根據(jù)本發(fā)明的實施方案，組合治療以每天1單位劑量到10單位劑量的速度給藥。按照本發(fā)明，治療方法的給藥可以連續(xù)至少一天的時期，某些情況下可以對個體終身給藥。
全部引入本文作為參考的美國專利號4,956,355(Prendergast)公開了通式(1)的化合物。
優(yōu)選地在通式(Ⅰ)的化合物中，R1和R2各是氫。特別優(yōu)選的化合物是脫氫表雄酮(DHEA)，其中R和R1各是氫并存在雙鍵。
在本發(fā)明的另一實施方案中，該化合物是表雄酮，其中R和R1各是氫并存在雙鍵。這一5-位不飽和的甾類同時也可以作為抗病毒藥劑制備，其中R位置由下面任一鹵素(溴，氯，氟，碘)占據(jù)。
在本發(fā)明的另一實施方案中，該化合物是16α-溴表雄酮，其中R是溴，R1是H并且存在雙鍵。仍然在另一實施方案中，該化合物是通式1的物質(zhì)，其中R是溴，R1是H，但不存在雙鍵(即，通式1顯示的點線處是單鍵)。
其它優(yōu)選的化合物是硫酸脫氫表雄酮。其中R是H,R1是SO2-OM，并且M如本文前面定義，和存在雙鍵，以及5β-雄甾烯-3β-醇-17酮。
可選擇的方法，該化合物選自硫酸酯，磷脂或葡糖苷酸脫氫表雄酮，其中R是H,R1如本文上面定義是硫脂，磷脂，或葡糖苷酸基團(tuán)并存在雙鍵。特別是，當(dāng)R1不是氫，該化合物是DHEA共軛物，如己基硫酸酯，十二烷基硫酸酯，十八烷基硫酸酯，十八?；叶剂蛩狨?，O-雙十六烷基甘油基硫酸酯，十六烷基磺酸酯，雙十八酰基甘油磷酸酯，O-十六烷基甘油磷酸酯。在休斯頓的研究在HIV-病人中使用DHEA治療的實驗證據(jù)已經(jīng)證明在四星期的DHEA單一治療后如抗體ELISA方法測量，IL-12水平上升，天然殺傷細(xì)胞水平與γ干擾素的合成和存在一起增加，通過HIV PCR(RNA)測量和定量培養(yǎng)技術(shù)測量的HIV病毒負(fù)荷顯示超過一個對數(shù)以上的減少。但是，當(dāng)病毒負(fù)荷水平相當(dāng)大地減少時，不發(fā)生Th1免疫改良。事實上，由于利用DHEA的單一治療產(chǎn)生的白細(xì)胞介素12水平的增高，白細(xì)胞介素10的水平增加，這引起了T4(輔助物)細(xì)胞數(shù)目隨后下降和Th1的消失(緩發(fā)型超敏感應(yīng)答)。通過DHEA單一治療如病人資料證實的病人中的皮膚反應(yīng)減量調(diào)節(jié)。與前面的一些認(rèn)識相反，皮膚反應(yīng)只能通過除去在DHEA單一治療中升高的白細(xì)胞介素10而恢復(fù)。在舊金山的研究(體內(nèi))下面是在患有HIV疾病的病人中的口服DHEA(脫氫表雄酮)的耐受性和藥學(xué)動力學(xué)的開放標(biāo)記自動調(diào)整劑量試驗中使用DHEA作為單一治療的概要。在DHEA試驗的第一期(早期癥狀的HIV疾病和200到500個CD4+淋巴細(xì)胞/微升)中，對照，分配安慰劑的病人中的絕對CD4數(shù)目以每月5個細(xì)胞的中數(shù)下降。相反，DHEA試驗第一期中研究的最低劑量組中的病人(預(yù)期它們的免疫系統(tǒng)將不會比其它試驗中安慰劑治療的病人下降得更快)具有每月31個細(xì)胞的CD4+中數(shù)下降。利用結(jié)合治療進(jìn)行體內(nèi)試驗為了抵抗這一DHEA單一治療的Th1抑制性免疫副作用，不得不將這一抗病毒甾類與一種藥劑組合使用以便抑制或中斷白細(xì)胞介素10的合成和/或作用。這一組合治療是使用所述的抗病毒藥劑(通式1的化合物)的優(yōu)選實施方案，其中抗病毒藥劑被允許產(chǎn)生Th1應(yīng)答。抵消抗病毒治療的Th1抑制性白細(xì)胞介素10免疫副作用效果的組合治療的成分可以是白細(xì)胞介素10的原始的多克隆或單克隆抗血清和/或抑制或中斷不需要的白細(xì)胞介素10的合成或效果的化合物。在全部引入本文作為參考的美國專利號5,292,725(Prendergast)中公開了抑制白細(xì)胞介素10的代表性化合物，它們可以用于組合治療以便抵抗抗病毒單一治療的Th1抑制免疫副作用。
相對于單一治療，當(dāng)對HIV+病人進(jìn)行組合治療給藥時，每個患者血液中的病毒顆粒的去除增加了3的對數(shù)值，同時增強(qiáng)80％以上的Th1(T4輔助細(xì)胞數(shù))。在血清轉(zhuǎn)換中失去的延緩型超敏感應(yīng)答同時得到恢復(fù)。這一組合治療利用了與抑制白細(xì)胞介素10合成和/或白細(xì)胞介素10的效果必需的抗血清和/或化合物組合的作為非毒性，非抗性菌株開發(fā)抗病毒藥劑的DHEA，允許獲得實質(zhì)性的治療優(yōu)勢，這是前面單獨使用DHEA單一治療時不能完成的。免疫系統(tǒng)的正向調(diào)節(jié)的有益作用和通式1的化合物(美國專利號4,956,355-Prendergast)的抗病毒作用給藥將比HIV治療具有更廣泛的治療用途。討論在DHEA給藥后的細(xì)胞因子生產(chǎn)方面允許我們總結(jié)前面有關(guān)DHEA治療中敘述的治療優(yōu)勢。我們現(xiàn)在知道DHEA治療對狼瘡病人和其它Th1自體免疫癥狀的治療優(yōu)勢直接與通過DHEA給藥的病人中獲得內(nèi)源的白細(xì)胞介素10水平的增加有關(guān)。通過DHEA給藥增強(qiáng)IL-10水平，骨髓移植的排斥反應(yīng)得到緩解。醫(yī)生的報告病人RD-DOB14/7/1983RD是由我治療的病人。他在異基因骨髓移植之后急性骨髓白血病M3得到緩解。他的主要現(xiàn)行問題是GUT抗寄主移植排斥疾病和嚴(yán)重的肺病。RD的一般健康狀況在過去3個月中得到改善。這是他進(jìn)行治療的結(jié)果，現(xiàn)在他從診斷以來第一次擁有良好的健康，他已經(jīng)能夠全天在學(xué)校了。他不再需要鼻胃進(jìn)食或遭受腹瀉。他的肺功能仍然是30％，但他的鍛煉耐受力明顯地提高了。他不再需要輪椅并能承受輕量鍛煉。因為他沒有進(jìn)行其它藥物治療方法并服這種藥劑將近3個月，我們不得不認(rèn)為這種治療在他身體中產(chǎn)生了這些有益的效果。在開始治療以前，每天對他噴霧Ventolin,Atrovent和Pulmicort四次并必要時口服甾類?，F(xiàn)在他一天只噴霧兩次。我從未見過他的健康有如此巨大的進(jìn)步，并且沒有明顯副作用。
在我們的實驗中內(nèi)源白細(xì)胞介素10水平得到升高的病人的狼瘡癥狀得到緩解，而已經(jīng)給藥DHEA，由于其它細(xì)胞因子和免疫因子沒有經(jīng)歷白細(xì)胞介素10的升高的病人，沒有證實癥狀的緩解。所以，我們已經(jīng)確定導(dǎo)致這些自體免疫癥狀的立即緩解的更直接的手段是以重組的白細(xì)胞介素10外源地給藥以便簡化狼瘡和抗寄主移植排斥反應(yīng)癥狀的緩解。
前面敘述的DHEA潛在的治療優(yōu)勢的另一方面是增強(qiáng)老年人的免疫系統(tǒng)對疫苗抗原的識別。現(xiàn)在這已經(jīng)通過分析對DHEA作為疫苗佐劑的治療效率得到的白細(xì)胞介素10水平得到鑒定和證實。我們已經(jīng)鑒定對老年人施用重組的白細(xì)胞介素10結(jié)合使用或治療以前使用產(chǎn)生增強(qiáng)的佐劑效率的抗原疫苗，該疫苗直接增強(qiáng)抗體應(yīng)答。而對于DHEA，有機(jī)會不產(chǎn)生白細(xì)胞介素10水平的升高。DHEA治療的效率真正依賴于得到的代謝血液水平和DHEA與疫苗抗原一起或在其給藥之前對病人給藥的時間安排。重組白細(xì)胞介素10的共給藥是在老年人或非常年輕的病人中獲得增強(qiáng)的抗體應(yīng)答的更直接的手段，并能去除易變的甾類代謝和與DHEA單一治療相關(guān)的細(xì)胞因子應(yīng)答。這第一次解釋了為什么DHEA在特異癥狀如狼瘡，MS和HIV的治療中經(jīng)常產(chǎn)生矛盾的應(yīng)答，因為真正的治療效率取決于細(xì)胞因子分布特征和免疫反應(yīng)，它們是在給藥甾類和它的類似物的基礎(chǔ)上產(chǎn)生的。所以，作為免疫調(diào)節(jié)子，DHEA的治療效率是不可預(yù)測的，并取決于在DHEA治療過程中或之前病人的甾類代謝和細(xì)胞因子分布特征。當(dāng)?shù)谝淮谓o藥甾類時，免疫治療應(yīng)答與患者有非常大的特異性，并不能可靠地產(chǎn)生一致的治療優(yōu)勢。只有通過直接使用需要的白細(xì)胞介素10細(xì)胞因子或通過共給藥白細(xì)胞介素10抑制劑和/或它們的特異的抗血清才能獲得需要的免疫治療應(yīng)答。在組合治療中這樣給藥DHEA將有助于白細(xì)胞介素12的增強(qiáng)而沒有白細(xì)胞介素10通常的負(fù)面效果，而Th1應(yīng)答是治療效果所需要的。用DHEA和應(yīng)答DHEA治療和不應(yīng)答DHEA治療的病人的細(xì)胞因子分布的特征的實驗使我發(fā)現(xiàn)上升的白細(xì)胞介素10是觀察到的負(fù)責(zé)減輕狼瘡臨床癥狀的治療應(yīng)答的活性藥劑。其它用DHEA和老年病人的細(xì)胞因子分布的實驗使發(fā)現(xiàn)白細(xì)胞介素10是在產(chǎn)生增強(qiáng)的疫苗應(yīng)答中起作用的活性藥劑，其中所述病人對疫苗抗原的應(yīng)答并且增強(qiáng)抗體生產(chǎn)。由于年齡的關(guān)系，通常，這一病人特征正常地減少抗原疫苗或免疫應(yīng)答。重復(fù)硬化是Th1自體免疫癥狀，需要白細(xì)胞介素10減量調(diào)節(jié)Th1免疫應(yīng)答并引起該癥狀的緩解。我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)DHEA治療對這一癥狀有與治療狼瘡?fù)瑯拥膽?yīng)答，即巨大的可治療病人的可變性。病人的內(nèi)源白細(xì)胞介素10水平明顯上升證明了重復(fù)硬化的癥狀的緩解。因此在Lewis大鼠中的重復(fù)硬化模型直接吸收重組的白細(xì)胞介素10證明了癥狀的緩解。如果在髓磷脂破壞之前以白細(xì)胞介素10給藥，這些癥狀完全可以防止。在華盛頓對HIV+血液的體外DHEAIL-12的研究證明DHEA增強(qiáng)白細(xì)胞介素12的內(nèi)源水平的方案由DHEA對HIV特異性細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答的恢復(fù)通過在存在gp120時，加入DHEA或IL-12刺激一個HIV-1陰性對照(E9B)和三個HIV-1陽性標(biāo)本(E9C,E9E和E9F)。在這些病例中DHEA引起的刺激相等于或大于IL-12引起的，雖然DHEA引起刺激的濃度隨不同樣品而不同。在余下的血樣中，加入DHEA或IL-12抑制存在gp120時E9A(HIV-1陰性)以及E9D和E9G(HIV-1陽性)增殖。
人IL-12是含有40和35-kD亞單位的二硫鍵連接的雜二聚體細(xì)胞因子。編碼這一細(xì)胞因子的基因已經(jīng)被克隆并且已經(jīng)生產(chǎn)了純化的重組蛋白。最近已經(jīng)證明對鼠體內(nèi)給藥鼠白細(xì)胞介素12(IL-12)導(dǎo)致細(xì)胞毒性天然殺傷細(xì)胞(NK)淋巴細(xì)胞激活的殺傷細(xì)胞的活性增強(qiáng)，胞溶性的T細(xì)胞的產(chǎn)生增強(qiáng)，和誘導(dǎo)干擾素γ的分泌。在這一研究中，鼠IL-12抗許多鼠腫瘤的體內(nèi)活性得到增加。在用IL-12腹膜內(nèi)治療的鼠中明顯減少了B16F10黑素瘤的實驗性的肺部轉(zhuǎn)移和皮下生長，導(dǎo)致生存時間的增加。IL-12的治療效率是依賴于劑量的，IL-12在沒有產(chǎn)生嚴(yán)重毒性的劑量時有效地治療皮下腫瘤。在確定的皮下Renca腫瘤中在腫瘤外周局部注射IL-12導(dǎo)致這些腫瘤的退化和完全消失。IL-12在NK細(xì)胞缺陷的米色鼠或用antiasialo GM1腫瘤剝離NK細(xì)胞活性的鼠中是有效的，表明NK細(xì)胞不是傳導(dǎo)這一細(xì)胞因子的抗腫瘤效應(yīng)的最初的細(xì)胞類型。但是，在裸鼠中IL-12的效力大大減弱，表明T細(xì)胞的參與。另外，CD8+而不是CD4+T細(xì)胞的剝離明顯減弱IL-12的效力。這些結(jié)果證明對于鼠腫瘤，IL-12具有潛在的體內(nèi)抗腫瘤和抗轉(zhuǎn)移效果并同時證明CD8+T細(xì)胞在介導(dǎo)抗皮下腫瘤的抗腫瘤效應(yīng)中起關(guān)鍵作用。在洛山磯對病人研究在這一專利進(jìn)行的HIV+病人研究中證明了白細(xì)胞介素12參與CD8+細(xì)胞的產(chǎn)生。通過以抗人白細(xì)胞介素10的多克隆抗體給藥，具有CDE8+細(xì)胞群體的病人顯示在基線值以上84％的增加并且HIV病毒負(fù)荷減弱到零。由于恢復(fù)HIV特異性細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答，除去白細(xì)胞介素10允許CD8+細(xì)胞增加并允許清除HIV病毒。
多克隆抗血清的說明產(chǎn)品說明名稱兔抗人IL-10形式液體濃度2.7毫克/毫升穩(wěn)定劑 沒有防腐劑 沒有無菌度 過濾滅菌寄主類型兔抗體類型IgG所用抗原重組人IL-10純化方法離子交換層析定量方法Pierce BCA蛋白質(zhì)測定特異性 人IL-10交叉反應(yīng)性 用EIA測定的與WHO標(biāo)準(zhǔn)IL-1a,IL-1B,IL-2,IL-3,IL-4,IL-6,IL-7,IL-8,MIP-1a,TNFa和GM-CSF沒有交叉反應(yīng)儲存4℃短期，-20℃長期材料和藥劑用于證明DHEA增強(qiáng)白細(xì)胞介素12合成的能力1．IL-2 ELISA，實驗室可得，最少6個平板2．MTS測試，Promega，最少7個平板3．IL-12 R&D系統(tǒng)，(#219-IL)5fg足夠用于整個實驗4．人IL-2受體的抗體，R&D系統(tǒng)(AB-233-NA)，1毫克凍干，羊人。
5．抗人IL-2的p40鏈的兔多克隆抗體，MA，劍橋遺傳研究所(617-498-8647)6．天然gp120，實驗室可得(50fg/小瓶，約1毫克/毫升)需要5納摩爾/毫升。50fg足夠用于各兩個平板的測試。
7．未受刺激的正常人(HIV-1陰性)PBMC8．5個HIV+L樣，從中得到非應(yīng)答PBMC，每樣品5毫升9．DHEA(脫氫表雄酮)，希格瑪D4000,1克足夠用于整個實驗
10．溶解DHEA的100％的乙醇11．R10培養(yǎng)基RPM1,10％PBS,50fg/毫升慶大霉素12．96孔平底組織培養(yǎng)級群集培養(yǎng)盤，每血樣2個盤方案1．對每個血樣，分離出PBMCs并對細(xì)胞計數(shù)2．利用所有病人樣品中得到的細(xì)胞。如果存在10×106個或多個細(xì)胞，在兩個96孔平板中播種細(xì)胞。對于10×106個細(xì)胞，達(dá)到0.5×105個細(xì)胞/孔或2.5×105個細(xì)胞/毫升結(jié)束。如果更少，只利用一個平板。紀(jì)錄每孔實際培養(yǎng)的數(shù)目。如果使用兩個平板，一個用于IL-2檢測并將接受人IL-2受體的抗體。另一平板將用于細(xì)胞增殖測試并不接受該抗體。如果只使用一個平板，該平板將接受抗體。
3．如果使用一個平板，在20毫升R10中重懸浮細(xì)胞。如果使用兩個平板重懸浮于40毫升。每孔200 fL等分試樣。允許過夜穩(wěn)定。如果自然穩(wěn)定不可行，將平板包裹在塑料包皮中，并利用溫和離心。
4．制備方案表明特殊培養(yǎng)基將加到孔中。(已知由于IL-2 ELISA需要空白和標(biāo)準(zhǔn)，不是所有生長的重復(fù)試樣都用于ELISA)5．每個實驗需要16或32毫升含有5納摩爾/毫升的天然gp120的培養(yǎng)基。FW=120,000。在每16毫升中加入96fL的100fg/毫升的儲液(每毫升培養(yǎng)基加入6fL的100fg/毫升)。
同時每個測試使用12或24毫升的R10培養(yǎng)基注意這是PBMC是否發(fā)生反應(yīng)的關(guān)鍵。如果存在gp120和沒有g(shù)p120時細(xì)胞增殖和產(chǎn)生IL-2，這些細(xì)胞是正常反應(yīng)細(xì)胞。如果它們與對方有同樣的增殖和IL-2生產(chǎn)，不管是否加入gp120，細(xì)胞是不反應(yīng)的。只有在非反應(yīng)細(xì)胞中，我們應(yīng)該看到IL-12和DHEA的效果。
6．在用于IL-12的ELISA的每個樣品的16毫升含有g(shù)p120和12毫升R10培養(yǎng)基中，加入2fg/毫升的抗IL-2受體的抗體。
7．DHEA的制備7.1在1毫升純乙醇(100％)中溶解1克DHEA。在37℃水浴溫育。其它乙醇可以加入到3.47毫升。這將得到1M溶液。如果全部3.47毫升對于配成溶液不必要，則對于R10培養(yǎng)基可以有些差別。
7.2對于每個樣品，我們需要下面濃度的DHEA,10-4,10-6,10-10,10-12的培養(yǎng)基。
7.3如果使用第二個平板，每次稀釋制備2毫升培養(yǎng)基(已經(jīng)含有g(shù)p120和步驟6的抗體)和含有另外2毫升含有g(shù)p120但沒有抗體的培養(yǎng)基。對于10-8，各需要6毫升。
在每次稀釋中，制備2×1.5毫升的R10培養(yǎng)基，沒有g(shù)p120，有或沒有步驟6的抗體。對于10-8，各需要3毫升。
7.4進(jìn)行稀釋。使用5毫升的試管。
A．將20fL的1M DHEA加入到2毫升的R10培養(yǎng)基=10-2M。
B．將20fL的10-2M DHEA加入到2毫升的步驟4.3培養(yǎng)基中=10-4M。
將15fL的10-2M DHEA加入到1.5毫升的R10中=10-4M。
C．將20fL的10-4M DHEA加入到2毫升的步驟4.3培養(yǎng)基=10-6M。
將15fL的10-4M DHEA加入到1.5毫升的R10=10-6M。
D．將40fL的10-6M DHEA加入到4毫升的步驟4.3培養(yǎng)基=10-8M。
將30fL的10-6M DHEA加入到3毫升的R10=10-8。
E．將20fL的10-8M DHEA加入到2毫升的步驟4.3培養(yǎng)基=10-10M。
將15fL的10-8M DHEA加入到1.5毫升的R10=10-10M。
F．將20fL的10-10M DHEA加入到2毫升的步驟4.3培養(yǎng)基=10-12M。
取15fL的10-12M。
7.5在10-8M DHEA培養(yǎng)基的一半中加入抗人IL-12的抗體。
7.6每個平板中的IL-12培養(yǎng)基A．在2毫升含有和沒有抗IL-2的抗體的gp120培養(yǎng)基中加入10單位/毫升重組的IL-12。
B．在1.5毫升含有和沒有抗IL-2抗體的R10中加入10單位/毫升的重組IL-12。
C．1ED50=1單位。對于該藥劑，文獻(xiàn)中接受了IL-12的ED50。
8．從細(xì)胞中吸走培養(yǎng)基，根據(jù)本方案，在每孔中加入200fL合適的培養(yǎng)基。在外周孔中放額外的培養(yǎng)基。用塑料包皮包裹平板，放置于有水的盤中。在37℃,5％CO2中溫育。
9．如果這是兩個平板的測試。5天之后在從沒有抗IL-2受體的抗體的平板中吸走培養(yǎng)基。用100fL/孔的R10培養(yǎng)基替代。用4小時溫育進(jìn)行細(xì)胞增殖測試。
10．在利用含有抗IL-2受體的抗體7天后，取100fL/每孔，用于進(jìn)行IL-2 ELISA。
11．如果只有一個平板用于測試，除去和冰凍每孔中的上清液的余下部分，然后在7天時加入100fL/孔的R10培養(yǎng)基和進(jìn)行細(xì)胞增殖測試。
12．從HIV-血液首先進(jìn)行PBMC以便看是否所有藥劑如前面預(yù)期的用HIV+樣品進(jìn)行的那樣。
13．在所有HIV+樣品完成后，另一HIV-樣品應(yīng)該進(jìn)行測試。
14．編輯和分析數(shù)據(jù)。
方案概要題目為患有HIV感染，已經(jīng)發(fā)展為對蛋白酶和RT抑制劑有抗性的人特別配制的和作為特異的白細(xì)胞介素10的抑制劑的異戊烯5′-單磷酸腺苷結(jié)合給藥的DHEA的臨床試驗與異戊烯5′-單磷酸腺苷組合的DHEA本文稱為化合物(D+1)。
適應(yīng)癥HIV-1感染的治療研究類型I/Ⅱ期臨床試驗研究目的a．確定給藥的化合物(D+1)在患有晚期的HIV疾病的人中的安全性和耐受性。
b．確定化合物(D+1)的給藥的對HIV病毒負(fù)荷的作用。與HIV p24抗原一起的血清PCR(RNA)水平(通過酸分離方法)。
c．確定給藥的化合物(D+1)的免疫性和毒性效果。
d．確定給藥的化合物(D+1)的藥學(xué)動力學(xué)。
包含體標(biāo)準(zhǔn)a．年齡18或更大；b．HIV-1血清陽性；c．在相距72小時到28天分別測量兩個獨立的情況，在進(jìn)入研究之前一個月內(nèi)CD4+-T-淋巴細(xì)胞計數(shù)為50到300細(xì)胞/立方毫米；d．下面是基本實驗值血紅蛋白＞9克/dlWBCs＞1500個細(xì)胞/微升嗜中性白細(xì)胞＞1000個細(xì)胞/微升血小板25,000個細(xì)胞/微升膽紅素＜2.0毫克/dlAST,ALT，堿性磷酸酶＜5×正常的上限肌酸酐＜1.5毫克/dle．前面抗逆病毒治療的歷史如下f．在以前有單獨利用AZT,ddl,ddC或d4T或與蛋白酶抑制劑組合使用的抗逆病毒治療歷史的病人中，在開始研究時不接受這樣的治療。這些病人在開始研究時必須中斷這些藥劑。
g．有懷孕能力的婦女應(yīng)用合適的避孕方法(對于有懷孕能力的婦女在開始研究之前一星期內(nèi)需要進(jìn)行一個陰性血清懷孕測試，β-HCG)。
h．在開始研究時，高PR HIV RNA效價的培養(yǎng)基。
例外的原則a．在登記的八星期內(nèi)先用化學(xué)治療藥劑治療過；b．活化的，主要的感染，包括確定為AIDS的隨機(jī)的感染，或其它威脅生命的醫(yī)學(xué)危機(jī)；c．懷孕或哺乳期；d．以研究者的意見，將使病人處于危險或危及試驗的目的的任何癥狀；e．在開始研究時，接受包括干擾素或藥學(xué)劑量的甾類免疫調(diào)節(jié)治療劑；安全測量每周分析下面的參數(shù)直達(dá)4星期?。焕录奈募峁┖驮u估。
ⅱ．血液學(xué)。
ⅲ．臨床化學(xué)和尿分析。
ⅳ．化合物(D+1)導(dǎo)致的免疫應(yīng)答的評估。
ⅴ．隨治療改變的PCR(DNA)和DNA測量的評估。
測量效果病毒負(fù)荷的測定包括HIV-p24抗原血癥，和HIV-RNAPCR(無細(xì)胞，血清)和細(xì)胞HIV-DNA分析。
當(dāng)從CD4/CD8比例中的基線改變時，測出免疫應(yīng)答的改善。在白細(xì)胞介素10水平對臨床淋巴細(xì)胞計數(shù)，以WBC中百分?jǐn)?shù)的變化表示，這將證明化合物(D+1)引起病人的免疫系統(tǒng)朝TH-1狀態(tài)移動的能力。
由總體重，Karnofsky性能得分，和基底時疾病的信號和癥狀的改變對臨床優(yōu)點進(jìn)行評估。
將對新的隨機(jī)的感染的緩解和發(fā)生進(jìn)行概括。
研究設(shè)計開放標(biāo)記，每天給藥的劑量為每個病人1200毫克/天。在治療4星期后，總結(jié)和評估供給劑量時間表和效率。
研究規(guī)模5個病人(總共)-5個病人@1200毫克/天，30天。
測試物品測試藥物化合物(D+1)顆粒大小分布，87％；＜5μm,100％；＜15μm，以每膠囊200毫克的明膠膠囊給藥。每膠囊含有600毫克的DHEA和600毫克的異戊烯5′-單磷酸腺苷。
對照藥物沒有安慰劑沒有在化合物(D+1)給藥之前和以后需要的病人資料。
權(quán)利要求
1．增強(qiáng)Th1免疫保護(hù)應(yīng)答的方法，該方法利用一種或多種的17-酮甾類化合物作為抗病毒，抗細(xì)菌，抗菌質(zhì)或抗細(xì)胞內(nèi)寄生蟲藥劑，該方法是將該藥劑與白細(xì)胞介素10的多或單克隆的抗血清(細(xì)胞因子抑制因子)，或任何能夠有效地抑制這一特異細(xì)胞因子白細(xì)胞介素10(DHEA單一治療不利地增強(qiáng)了白細(xì)胞介素10的合成)的合成和生物學(xué)功能的化合物，或與白細(xì)胞介素10(細(xì)胞因子抑制因子)受體分子封阻試劑一起組合使用。
2．增強(qiáng)Th2免疫應(yīng)答的方法，該方法利用一種或多種17-酮甾類化合物作為抗病毒，抗細(xì)菌或抗細(xì)胞內(nèi)的寄生蟲藥劑，該方法是將該藥劑與抗白細(xì)胞介素12的多或單克隆抗血清，或與可以有效地抑制這一特異細(xì)胞因子白細(xì)胞介素12的合成或生物學(xué)功能的任何化合物，或與白細(xì)胞介素12受體分子封阻試劑一起組合使用，在Th1激活疾病狀態(tài)的過程，DHEA單一治療不利地增強(qiáng)了白細(xì)胞介素12的合成。
3．增強(qiáng)Th2免疫應(yīng)答的方法，該方法利用一種或多種17-酮甾類化合物作為抗病毒，抗細(xì)菌或抗細(xì)胞內(nèi)的寄生蟲藥劑，該方法是將該藥劑與抗白細(xì)胞介素2的多或單克隆抗血清，或與可以有效地抑制這一特異細(xì)胞因子白細(xì)胞介素2的合成或生物學(xué)功能的任何化合物，或與白細(xì)胞介素2受體分子封阻試劑一起組合使用，在Th1激活疾病狀態(tài)的過程，DHEA單一治療不利地增強(qiáng)了白細(xì)胞介素12的合成。
4．增強(qiáng)Th1免疫應(yīng)答的方法，該方法利用一種或多種17-酮甾類作為抗病毒，抗細(xì)菌，抗菌質(zhì)或抗寄生蟲藥劑，該方法是將該藥劑與人α-胎兒蛋白或同樣的人細(xì)菌，病毒或合成起源的多克隆或單克隆抗血清一起使用。
5．根據(jù)權(quán)利要求1-4中任何一個所述的方法，其中病人需要Th1免疫保護(hù)應(yīng)答，病人需要抗癌，抗病毒，抗轉(zhuǎn)移，抗多種藥物抗性癌細(xì)胞和/或細(xì)菌非抗性細(xì)菌感染治療。
6．根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中將多克隆和/或單克隆抗血清用于除去或中和白細(xì)胞介素10并特異地抗埃巴二氏病毒開放讀碼框架BCRF1，該框架具有與人細(xì)胞因子合成抑制因子(白細(xì)胞介素10)同源的氨基酸序列。
7．對病人進(jìn)行組合治療給藥的方法，該方法是給藥至少一種17-酮甾類和白細(xì)胞介素10抑制劑或白細(xì)胞介素10受體分子封阻試劑。
8．對病人進(jìn)行組合治療給藥的方法，該方法是至少給藥一種17-酮甾類與白細(xì)胞介素12抑制劑或白細(xì)胞介素12受體分子封阻試劑。
9．對病人進(jìn)行組合治療給藥的方法，該方法是至少給藥一種17-酮甾類與白細(xì)胞介素2抑制劑或白細(xì)胞介素2受體分子封阻試劑一起給藥。
10．治療或抑制病人的免疫功能障礙的發(fā)展的方法，該病人需要這樣的治療，該方法包括以至少一種17-酮甾類與白細(xì)胞介素10抑制劑或白細(xì)胞介素10受體分子封阻試劑一起給藥進(jìn)行組合治療。
11．治療或抑制病人的免疫功能障礙的發(fā)展的方法，該病人需要這樣的治療，該方法包括以至少一種17-酮甾類與白細(xì)胞介素12抑制劑或白細(xì)胞介素12受體分子封阻試劑一起給藥進(jìn)行組合治療。
12．治療或抑制病人的免疫功能障礙的發(fā)展的方法，該病人需要這樣的治療，該方法包括以至少一種17-酮甾類與白細(xì)胞介素2抑制劑或白細(xì)胞介素2受體分子封阻試劑一起給藥進(jìn)行組合治療。
13．對病人進(jìn)行給藥的方法，該方法將重組或克隆的白細(xì)胞介素10給藥用于治療狼瘡和/或抗寄主移植排斥疾病。
14．對病人進(jìn)行給藥的方法，該方法在疫苗治療中以重組或克隆的白細(xì)胞介素10作為佐劑。
15．對需要所述治療的病人的多種硬化癥進(jìn)行治療的方法，該方法包括對所述病人以重組或克隆的白細(xì)胞介素10給藥。
16．對需要治療的病人的狼瘡或抗寄主移植排斥疾病進(jìn)行治療的方法，該方法包括對所述病人以重組或克隆的白細(xì)胞介素10給藥。
17．根據(jù)權(quán)利要求1,7或10所述的方法，其中白細(xì)胞介素10的合成受到下面化合物的任何一個或組合的抑制-硫酸刀豆氨酸，L-硫酸刀豆氨酸，HeroimycinA，染料木因，黑麥酸D，異黃素類化合物，細(xì)胞激動素，兩親性的三萜類，或上面任何一種的類似物。
18．根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法，其中細(xì)胞激動素選自具有下面通式的組
其中R1=H,R2=CH3,R3=CH3，和R4=H，或R1=H或CH3S和
和R5=CH3,Cl,OH或單磷酸基團(tuán)R6=CH3,CH2OH或ClR7=H或Br或R1=H和
和X1,X2各自選自H，甲基，乙基，羥基，鹵素和羧基或
或
或
和
或R8=(CH2)7CH3；和R2=OH和R3=OH，單磷酸，二磷酸或三磷酸基團(tuán)，或者將R2和R3連接在一起形成3′,5′-環(huán)化單磷酸衍生物，或所述化合物的代謝物，所述代謝物是包括下面物質(zhì)的組N6-(Δ2-異戊烯基)腺苷；6-N-(3-甲基-3-羥丁氨基)嘌呤；腺苷；次黃嘌呤；尿酸；和甲基化黃嘌呤。
19．根據(jù)權(quán)利要求1-12,17和18中的任何一個所述的方法，其中所述17-酮甾類具有通式
其中R是氫原子，和R1是選自由氫原子，SO2OM基團(tuán)(其中M選自由氫原子，鈉原子的基團(tuán)組成的組)，硫酸酯基團(tuán)組成的組的化學(xué)基團(tuán)
其中R2和R3可以相同或不同，各選自由1-14個碳原子的直鏈和支鏈烷基的基團(tuán)，磷酸酯基團(tuán)組成的組
其中R2和R3可以相同或不同，各選自由1-14個碳原子的直鏈和支鏈烷基的基團(tuán)，和葡糖苷酸基團(tuán)組成的組
在位置5的原子有α-或β-構(gòu)型，或該化合物包括兩種構(gòu)型的混合物。
20．對需要所述治療的病人的病毒感染，細(xì)菌感染，菌質(zhì)感染或寄生蟲感染進(jìn)行治療的方法，包括對所述病人給藥(1)一種或多種17-酮甾類化合物，和(2)選自由抗白細(xì)胞介素10的多或單克隆抗血清，可以有效抑制白細(xì)胞介素10的合成或生物功能的化合物，和白細(xì)胞介素10受體分子封阻試劑組成的組。給藥的各成份的量是提供所述治療有效的量。
21．根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，其中所述病人患有HIV感染。
22．對需要治療的病人的癌，病毒感染，轉(zhuǎn)移，多種藥物抗性癌和/或細(xì)菌，非抗性細(xì)菌進(jìn)行治療的方法，包括對所述病人給藥(1)一種或多種17-酮甾類化合物，和(2)一個或多個選自由白細(xì)胞介素10的多或單克隆抗血清，可以有效抑制白細(xì)胞介素10的合成或生物學(xué)功能的化合物，和白細(xì)胞介素10受體分子封阻試劑組成的組。各自給藥的量是提供所述治療有效的量。
23．對需要治療的病人的狼瘡或重復(fù)硬化癥和/或抑制排斥寄主疾病進(jìn)行治療的方法，包括對病人以重組或克隆的白細(xì)胞介素10給藥。
24．一種組合物，包括(1)一種或多種17-酮甾類化合物，和(2)一種或多種選自由白細(xì)胞介素10的多或單克隆抗血清的，可以有效白細(xì)胞介素10的合成或生物學(xué)功能的化合物，和白細(xì)胞介素10受體分子封阻試劑組成的組。
25．試劑盒，包括(1)至少一單位劑量的17-酮甾類化合物，和(2)至少一單位劑量的選自由白細(xì)胞介素10的多或單克隆抗血清，可以有效抑制白細(xì)胞介素10的合成或生物學(xué)功能的化合物，和白細(xì)胞介素10受體分子封阻試劑組成的組的一個或多個。
26．對需要治療的病人的狼瘡或多種硬化和/或移植排斥寄主疾病進(jìn)行治療的方法，該方法包括對所述病人以起源于存在于白細(xì)胞介素10分子或模仿白細(xì)胞介素10的免疫抑制作用的序列中的序列的重組或克隆序列給藥。
27．對需要治療的病人的癌，病毒感染，轉(zhuǎn)移，多種藥物抗性癌和/或細(xì)菌，非抗性細(xì)菌進(jìn)行治療的方法，包括對所述病人給予組合藥物的給藥，包括(1)重組或克隆白細(xì)胞介素12，和(2)一個或多個選自由白細(xì)胞介素10的多或單克隆的抗血清，可以有效抑制白細(xì)胞介素10的合成或生物學(xué)功能的化合物，白細(xì)胞介素10受體分子封阻試劑組成的組，各成份的量是提供所述的有效治療的量。
28．根據(jù)權(quán)利要求1,7或10所述的方法，其中白細(xì)胞介素10的合成受到下面化合物的任何一種或組合的抑制-硫酸刀豆氨酸，L-硫酸刀豆氨酸，Herbimycin A，染料木因，黑麥酸D，異黃素類化合物，兩親性三萜類，或上面任何一種的類似物。
29．根據(jù)權(quán)利要求1,7或10所述的方法，其中白細(xì)胞介素10的合成受到至少一種細(xì)胞激動素的抑制，附帶條件是所述的細(xì)胞激動素不是選自具有下面通式的組
其中R1=H,R2=CH3,R3=CH3和R4=H，或R1=H或CH3S，和
和R5=CH3,Cl,OH或單磷酸基團(tuán)R6=CH3,CH2OH或ClR7=H或Br或R1=H和
和X1和X2各自選自H，甲基，乙基，羥基，鹵素，和羧基或
或
或
和
或R8=(CH2)7CH3；和R2=OH和R3=OH，單磷酸，二磷酸，三磷酸基團(tuán)或?qū)2和R3連接在一起形成環(huán)化3′,5′環(huán)化單磷酸衍生物，或所述化合物的代謝物，所述代謝物是由N6-(Δ2-異戊烯基)腺苷6-N-(3-甲基-3-羥丁氨基)嘌呤；腺苷；次黃嘌呤；尿酸；和甲基化黃嘌呤組成的組。
30．對需要治療的病人的狼瘡或移植排斥寄主疾病進(jìn)行治療方法，包括對所述病人給藥(1)一種或多種17-酮甾類化合物，(2)選自由白細(xì)胞介素12的多或單克隆抗血清，可以有效抑制白細(xì)胞介素12的合成或生物學(xué)功能的化合物，和白細(xì)胞介素12受體分子封阻試劑組成的組的一個或多個。各自的劑量為提供所述的治療的有效量
31．對需要治療的病人進(jìn)行狼瘡或移植排斥寄主疾病的治療方法，包括對所述病人給藥(1)一種或多種17-酮甾類化合物，(2)選自由白細(xì)胞介素2的多或單克隆抗血清，可以有效抑制白細(xì)胞介素2的合成或生物學(xué)功能的化合物，和白細(xì)胞介素2受體分子封阻試劑組成的組的一個或多個。各自的劑量為提供所述的治療的有效量
32．對需要治療的病人的細(xì)菌感染，菌質(zhì)感染或寄生蟲感染進(jìn)行治療方法，包括對所述病人給藥(1)一種或多種的17-酮甾類化合物，(2)選自由白細(xì)胞介素12的多或單克隆抗血清，可以有效抑制白細(xì)胞介素12的合成或生物學(xué)功能的化合物，和白細(xì)胞介素12受體分子封阻試劑組成的組的一個或多個。各自的劑量為提供所述的治療的有效量。
33．對需要治療的病人的細(xì)菌感染，菌質(zhì)感染或寄生蟲感染進(jìn)行治療方法，包括對所述病人給藥(1)一種或多種17-酮甾類化合物，(2)選自由白細(xì)胞介素2的多或單克隆抗血清，可以有效抑制白細(xì)胞介素2的合成或生物學(xué)功能的化合物，和白細(xì)胞介素2受體分子封阻試劑組成的組的一個或多個。有關(guān)劑量為提供所述的治療的有效量。
34．在需要治療的病人中防止或減弱細(xì)菌易位的方法，包括對所述病人給藥(1)一種或多個17-酮甾類化合物，和(2)選自包括白細(xì)胞介素2的多或單克隆抗血清，可以有效抑制白細(xì)胞介素2的合成或生物學(xué)功能的化合物，和白細(xì)胞介素2受體分子封阻試劑的組的一個或多個。各自的劑量為提供所述的治療的有效量。
35．一種組成，包括(1)一種或多個17酮甾類化合物，和(2)選自包括白細(xì)胞介素12的多或單克隆抗血清的組，可以有效抑制白細(xì)胞介素12的合成或生物功能的化合物，和白細(xì)胞介素12受體分子封阻試劑的一個或多個。
36．藥劑盒，包括(1)至少一單位劑量的17酮甾類化合物，和(2)至少一單位劑量的選自由白細(xì)胞介素12的多或單克隆抗血清，可以抑制白細(xì)胞介素12的合成和生物學(xué)功能的化合物，白細(xì)胞介素12的受體分子封阻試劑組成的組的一個或多個。
37．組合物，包括(1)一種或多個17酮甾類化合物，和(2)選自由白細(xì)胞介素2的多或單克隆抗血清，可以有效抑制白細(xì)胞介素2的合成或生物功能的化合物，和白細(xì)胞介素2受體分子封阻試劑組成的組的一個或多個。
38．藥劑盒，包括(1)至少一單位劑量的17酮甾類化合物，和(2)至少一單位劑量的選自由白細(xì)胞介素2的多或單克隆抗血清，可以抑制白細(xì)胞介素2的合成和生物學(xué)功能的化合物，白細(xì)胞介素2的受體分子封阻試劑組成的組的一個或多個。
39．根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的白細(xì)胞介素抑制劑選自1)NG-單甲基-精氨酸(L-NMMA)，和1)硝基氫氰酸鈉(SNP)
全文摘要
提供了藥劑,生產(chǎn)這些藥劑的方法,和藥劑盒,包括(1)17－酮甾類化合物,和(2)抗白細(xì)胞介素10,白細(xì)胞介素2或白細(xì)胞介素12的多或單克隆抗血清,或包括有效抑制白細(xì)胞介素10,白細(xì)胞介素12,或白細(xì)胞介素2的合成或生物學(xué)功能的任何化合物,或包含白細(xì)胞介素10,白細(xì)胞介素12,或白細(xì)胞介素2的受體分子封阻試劑或含有抗人α－胎兒蛋白的多或單克隆抗血清。提供了包括這樣的化合物或化合物的組合的治療方法,包括當(dāng)使用17－酮甾類化合物作為抗病毒,抗病毒,抗菌質(zhì)或抗細(xì)胞內(nèi)的寄生蟲藥劑時增強(qiáng)Th
文檔編號A61P31/04GK1216470SQ97193912
公開日1999年5月12日 申請日期1997年4月17日 優(yōu)先權(quán)日1996年4月17日
發(fā)明者帕特里克·T·普倫德加斯特 申請人:帕特里克·T·普倫德加斯特