專利名稱：低hdl血癥改善劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及到以半胱氨酸蛋白酶抑制劑為有效成分的低HDL血癥改善劑和由該低HDL血癥改善劑構(gòu)成的動脈硬化預(yù)防和治療劑。
背景技術(shù)：
HDL(high-density lipoprotein；高密度脂蛋白)主要在肝臟和小腸上皮細(xì)胞合成、分泌的。剛分泌的HDL是以脫輔蛋白A-I(也稱之為apoAI)和磷脂為主要成分的圓盤狀粒子，也稱之為原始HDL。該HDL在血中接受來自末梢細(xì)胞的細(xì)胞膜的、或其他脂蛋白水解過程中生成的游離膽固醇，通過LCAT(lecithin cholesterol acyltransferase，卵磷脂膽固醇酰基轉(zhuǎn)移酶)的作用，一邊以膽固醇酯保持在疏水性中心部，一邊向球狀HDL成熟。
在于血液中獲取來自末梢組織的多余的膽固醇，將它轉(zhuǎn)運(yùn)到肝臟的稱為“膽固醇逆轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)”的脂代謝中，HDL對極其重要的生理功能也起著主要的作用，人們認(rèn)為這樣的膽固醇逆轉(zhuǎn)輸送系統(tǒng)對動脈硬化有預(yù)防作用。
除了上述生物化學(xué)知識外，有關(guān)血液中膽固醇濃度和動脈硬化的關(guān)系從到目前為止多次實(shí)施的免疫學(xué)調(diào)查中，確認(rèn)HDL膽固醇濃度越低，動脈硬化的發(fā)病頻率越高，可以說改善低HDL血癥從動脈硬化的預(yù)防和治療方面看是非常重要的。
現(xiàn)在，血中HDL量是以臨床上可容易測定的HDL組分的膽固醇(以下表示為HDL膽固醇)的濃度作為指標(biāo)測定的。就日本人來說，通常當(dāng)血中HDL膽固醇值低于40mg/dl時，診斷為“低HDL血癥”。
低HDL血癥在以動脈硬化為主，以及高脂血癥、腦梗塞、肥胖、糖尿病等多種疾病中經(jīng)常發(fā)現(xiàn)外，在以丹吉爾(Tangier)病為首的各種各樣的遺傳疾病中也可看到。
到目前為止，遺傳病出現(xiàn)的低HDL血癥治療困難多，而就在動脈硬化、高脂血癥、腦梗塞、肥胖、糖尿病等疾病中出現(xiàn)的低HDL血癥來說，針對HDL本身的有用的低HDL血癥改善劑也沒有看到，期待著它的出現(xiàn)。
另外就有關(guān)與在上述肝臟和小腸上皮細(xì)胞合成、分泌的HDL不同的脫輔脂蛋白為成分的HDL來說也獲得了有興趣的知識。
即，在腦的星狀細(xì)胞中合成、分泌的HDL以脫輔脂蛋白質(zhì)E(也稱之為apoE)和磷脂為主要成分，確認(rèn)apoE參與中樞神經(jīng)系統(tǒng)的損傷修復(fù)，在apoE存在下，通過腦星狀細(xì)胞損傷修復(fù)作用，可以使阿耳茨海默病等、與神經(jīng)障礙有關(guān)的疾病的發(fā)展推遲[Schiefermeier等，Stroke，31(9)，2068-2073(2000)]。因此，使在腦的星狀細(xì)胞中合成、分泌的apoE-HDL增加在有關(guān)神經(jīng)障礙或中樞神經(jīng)系統(tǒng)的損傷的疾病的預(yù)防和治療上非常重要。
另外，最近，Bodzioch等[Nat.Genet.，22，347-351(1999)]、Brooks-wilson等人[Nat.Genet.，22，336-345(1999)]以及Rust等人[Nat、Genet.，22，347-351(1999)]鑒定ABCA1(ATP-binding cassettetransport 1)為表現(xiàn)出HDL顯著低值的丹吉爾病的原因基因，低HDL血癥和ABCA1基因的關(guān)系引起了人們的注目。
ABCA1是主要存在于以肝臟、小腸、胎盤、腎上腺為首的各種臟器的細(xì)胞的細(xì)胞膜中的蛋白質(zhì)，到目前為止人們一直認(rèn)為它參與氨基酸、維生素、糖等物質(zhì)的膜轉(zhuǎn)運(yùn)[Annu.Rev.Cell，Biol，8，67-113(1992)]。
按照上述最近的見解，有報道說在丹吉爾病患者中由于在ABCA1基因存在變異，所以看不到脂代謝需要的ABCA1的表達(dá)，膽固醇向細(xì)胞外排泄被阻礙，HDL消失。
除了上述見解外，Richard等人[J.Clin.Invest.，104，R25-R31(1999)]和Von Bckardstein等人[The FASBB J.，15，1555-1561(2001)]發(fā)現(xiàn)ABCA1基因的導(dǎo)入促進(jìn)HDL的新生反應(yīng)，現(xiàn)正在進(jìn)行用基因工程技術(shù)使體內(nèi)的ABCA1的表達(dá)量增加，提高或調(diào)節(jié)HDL膽固醇的濃度的嘗試。
例如在WO00/78971和WO00/78972中公開了通過直接將ABCA1多肽導(dǎo)入宿主細(xì)胞，提高ABCA1的表達(dá)量和活性，用于謀求膽固醇流出和HDL濃度上升的技術(shù)。
如上所述，改善低HDL血癥從動脈硬化的預(yù)防和治療方面看是非常重要的，期待著針對HDL的有用的低HDL血癥改善劑的出現(xiàn)，根據(jù)最近得到的有關(guān)丹吉爾病的資料，進(jìn)行了使ABCA1的表達(dá)量增加，提高或調(diào)節(jié)HDL膽固醇濃度的嘗試。然而，這些嘗試無論哪一種都是使用基因工程技術(shù)的產(chǎn)物，即使是對遺傳疾病的治療是有效的，但對于與該遺傳疾病相比占絕大多數(shù)的動脈硬化、高脂血癥、腦梗塞、肥胖、糖尿病等疾病中出現(xiàn)的低HDL血癥還不能成為有用的改善劑。
由于這樣的狀況，人們期待著不需要基因工程技術(shù)，而能針對HDL的有用的低HDL血癥改善劑的出現(xiàn)。

發(fā)明內(nèi)容
因此，本發(fā)明人等為了發(fā)現(xiàn)不需要基因工程技術(shù)、而且能針對HDL的有用的低HDL血癥改善劑，使用以ABCA1的表達(dá)量上升為指標(biāo)的試驗(yàn)體系，就各種各樣物質(zhì)進(jìn)行了深入研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)半胱氨酸蛋白酶抑制劑可以使ABCA1的表達(dá)量大幅度而且持續(xù)上升，進(jìn)一步深入研究完成了本發(fā)明。
本發(fā)明提供1)一種以半胱氨酸蛋白酶抑制劑為有效成分的低HDL血癥改善劑。
2)根據(jù)1)所述的低HDL血癥改善劑，半胱氨酸蛋白酶抑制劑來自天然物或非天然物。
3)根據(jù)上述2)所述的低HDL血癥改善劑，來自天然物的半胱氨酸蛋白酶抑制劑源于微生物、植物或動物。
4)根據(jù)上述3)所述的低HDL血癥改善劑，源于微生物、植物或動物的半胱氨酸蛋白酶抑制劑是從亮抑蛋白酶肽、抗蛋白酶以及E-64中選出來的。
5)根據(jù)上述2)所述的低HDL血癥改善劑，來自非天然物的半胱氨酸蛋白酶抑制劑不是來源于微生物、植物或動物中的任一種，而是合成的物質(zhì)。
6)根據(jù)上述5)所述的低HDL血癥改善劑，來自非天然物的半胱氨酸蛋白酶抑制劑是ALLN或N-乙酰基leu-leu-蛋氨醛(methioninal)。
7)一種由上述1)～6)的任一項(xiàng)所述的低HDL血癥改善劑構(gòu)成的動脈硬化預(yù)防和治療劑；以及8)使用THP-1細(xì)胞，以ABCA1的表達(dá)為指標(biāo)篩選具有促進(jìn)HDL新生反應(yīng)作用的物質(zhì)的方法。
另一方面，本發(fā)明還提供9)該病癥或疾病的預(yù)防和/或治療法，其特征是將有效量的半胱氨酸蛋白酶抑制劑投給有低HDL血癥或動脈硬化癥危險因素的動物，以及10)半胱氨酸蛋白酶抑制劑的用途，將有效量的半胱氨酸蛋白酶抑制劑與醫(yī)藥上容許的載體配合后用于制造低HDL血癥改善劑或由低HDL血癥改善劑構(gòu)成的動脈硬化預(yù)防和治療劑。
本發(fā)明的其他目的、特征、優(yōu)點(diǎn)以及具有的觀點(diǎn)通過以下所述對本領(lǐng)域技術(shù)人員都會明白的。但是，包括以下所述以及具體的實(shí)施例等敘述在內(nèi)的本說明書的記載給出了本發(fā)明的優(yōu)選方式，但希望理解為只是為了說明給出的例子。在本說明書公開的本發(fā)明的意圖和范圍內(nèi)，做出各種的變化和/或改變(或修飾)通過以下所述以及本說明書的其他部分的知識對本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)容易明白。在本說明書中引用的所有專利文獻(xiàn)以及參考文獻(xiàn)應(yīng)當(dāng)理解為是為了說明的目的而引用的，這些文獻(xiàn)作為本說明書的一部分，其內(nèi)容也應(yīng)該解釋為包括在本說明書的內(nèi)容中。
附圖的簡單說明

圖1是表示試驗(yàn)例1結(jié)果的圖。
圖2是表示試驗(yàn)例2結(jié)果的圖。
圖3是表示試驗(yàn)例3結(jié)果的圖。
具體實(shí)施例方式
在本發(fā)明中提供以半胱氨酸蛋白酶抑制劑為有效成分的低HDL血癥改善劑和由該低HDL血癥改善劑構(gòu)成的動脈硬化預(yù)防和治療劑，以及該疾病的預(yù)防和治療方法。
本說明書中，所謂“半胱氨酸蛋白酶抑制劑”是對SH基為活性中心存在的蛋白酶半胱氨酸蛋白酶[生物化學(xué)詞典、第3版、(株)東京化學(xué)同人、637(1998)]表現(xiàn)出抑制作用的物質(zhì)，無論是來自天然物還是來自非天然物都可以。
所謂來自天然物的半胱氨酸蛋白酶抑制劑是源于微生物、植物或動物的半胱氨酸蛋白酶抑制劑，可以說是在微生物、植物或動物的組織生成、分離出的物質(zhì)。上述源于微生物、植物或動物的半胱氨酸蛋白酶抑制劑包括亮抑蛋白酶肽[生物化學(xué)詞典、第3版、(株)東京化學(xué)同人、1531(1998)]、抗蛋白酶[生物化學(xué)詞典、第3版、(株)東京化學(xué)同人、110(1998)]以及E-64[L-反-環(huán)氧琥珀酰-亮氨酰酰氨-(4-胍基)丁烷；生物化學(xué)詞典、第3版、(株)東京化學(xué)同人、150(1998)]等，另外還包括特開平10-77276號公開的源于微生物的半胱氨酸蛋白酶抑制劑和特開平7-48340號引用的源于微生物的半胱氨酸蛋白酶抑制劑等。其中優(yōu)選亮抑蛋白酶肽、抗蛋白酶以及E-64。
上述所謂來自非天然物的半胱氨酸蛋白酶抑制劑不是源于微生物、植物及動物的任一種，而是合成的物質(zhì)。上述源于非天然物的半胱氨酸蛋白酶抑制劑包括例如ALLN[N-乙?；鵯eu-leu-norleucinal；J.EnzymeInhibition，3，195(1990)]和N-乙?；鵯eu-leu-蛋氨醛[J.EnzymeInhibition，3，195(1990)]等，此外還包括以下給出的文獻(xiàn)和專利公報公開的半胱氨酸蛋白酶抑制劑。其中，優(yōu)選ALLN和N-乙?；鵯eu-leu-蛋氨醛。
Biochemical Biophysical Research Communications，取157，1117(1988)，J.Enzyme Inhibition，3，195(1990)、特開平7-48340號、特開平8-151355號、特開平8-325282號、特開平9-165360號、特開平9-169752號、特開平9-295996號、特開平10-147564號、特開平10-147566號、特開平11-1491號、特開平11-171881號、特開2001-139534號、特開2001-233847號、特表平11-507912號、特表2000-510447號、特表2001-505889號、特表2001-506596號、特表2001-506614號、WO96/25408、WO97/03060、WO98/47887、WO98/01133、WO98/04539。
上述半胱氨酸蛋白酶抑制劑無論哪一種都是已知物質(zhì)，可以使用按照上述文獻(xiàn)和專利公報中公開的方法等分離、合成的物質(zhì)或市售品，優(yōu)選使用作為醫(yī)藥品具有可耐受品質(zhì)和穩(wěn)定性級別的物質(zhì)。
作為該半胱氨酸蛋白酶抑制劑包括含有亮抑蛋白酶肽、抗蛋白酶、ALLN和N-乙?；鵯eu-leu-蛋氨醛等，可以舉出例如含有BiochemicalBiophysical Research Communications，157，1117(1988)、J.EnzymeInhibition，3，195(1990)等給出的化學(xué)結(jié)構(gòu)骨架的肽基醛衍生物，例如含有特開平7-48340號、特開平10-147564號、特開平10-147566號、特開2001-233847號等給出的化學(xué)結(jié)構(gòu)骨架的磺酰胺化肽基醛衍生物，例如含有E-64、特開平8-325282號、特開平10-77276號、特開平10-147566號、WO97/03060、WO98/47887等給出的化學(xué)結(jié)構(gòu)骨架的環(huán)氧琥珀酰胺衍生物，例如含有特開平9-169752號、特開平11-171881號、WO96/25408、WO98/04539等給出的化學(xué)結(jié)構(gòu)骨架的至少含有一個肽鍵的含氧雜環(huán)衍生物，含有特開平9-165360號、特開平11-1491號、特開平9-295996號等給出的化學(xué)結(jié)構(gòu)骨架的肽類，例如含有特開平8-151355號等給出的化學(xué)結(jié)構(gòu)骨架的酰基氨基醛衍生物，例如含有特開2001-139534號等給出的化學(xué)結(jié)構(gòu)骨架的纈氨酸衍生物，例如含有特表平11-507912號等中給出的化學(xué)結(jié)構(gòu)骨架的α-(1，3-二羰基烯醇基醚)甲基酮衍生物，例如含有特表2000-510447號等中給出的化學(xué)結(jié)構(gòu)骨架的4-氧雜-1-氮雜雙環(huán)[3，2，0]庚烷衍生物，例如含有特表2001-505889號、特表2001-5065967號等中給出的化學(xué)結(jié)構(gòu)骨架的苯(甲)酰胺醛衍生物，例如含有特表2001-506614號等中給出的化學(xué)結(jié)構(gòu)骨架的酮苯(甲)酰胺衍生物，例如含有WO98/01133等中給出的化學(xué)結(jié)構(gòu)骨架的脯氨酸衍生物等，或它們的改變體和修飾體等。
上述所謂低HDL血癥改善劑是對于基于臨床上診斷基準(zhǔn)的低HDL血癥使血中HDL膽固醇濃度上升，改善低HDL血癥的藥劑。通常當(dāng)日本人血中HDL膽固醇值低于40mg/dl時，稱之為低HDL血癥，但也包括變更該診斷基準(zhǔn)時，基于變更的診斷基準(zhǔn)的低HDL血癥。
低HDL血癥在丹吉爾病等遺傳病和動脈硬化、高脂血癥、腦梗塞、肥胖、糖尿病、甲狀腺功能異常、肝硬變、骨髓瘤、慢性腎衰竭、慢性炎性腸道疾病(例如，克羅恩氏病(節(jié)段性回腸炎)、潰瘍性大腸炎)等疾病中可看到，本發(fā)明的低HDL血癥改善劑除了可以在丹吉爾病等ABCA1在生物體內(nèi)不能正常合成的遺傳病使用外，也可以在上述疾病中的任一種場合的低HDL血癥中使用。
另外，本發(fā)明的低HDL血癥改善劑就象后面試驗(yàn)例表明的那樣，可以表現(xiàn)出很好的促進(jìn)HDL新生反應(yīng)作用，使血中HDL增加。血中HDL在如上所述對動脈硬化起到預(yù)防作用的膽固醇逆轉(zhuǎn)運(yùn)體系中起到主要的作用，具有增加血中HDL作用的本發(fā)明的低HDL血癥改善劑也可以用作動脈硬化的預(yù)防和治療劑。
就是說，出現(xiàn)低HDL血癥時，由于HDL的減少，膽固醇逆轉(zhuǎn)運(yùn)體系不能充分發(fā)揮功能，蓄積在血管壁的膽固醇難于轉(zhuǎn)運(yùn)到血管外，所以促進(jìn)動脈硬化。本發(fā)明的低HDL血癥改善劑可以改善這樣的狀態(tài)，可用于動脈硬化的預(yù)防和治療。
另外，本發(fā)明的低HDL血癥改善劑即使在腦中，通過使apoE-HDL濃度上升，促進(jìn)中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷修復(fù)作用，也可以用作與中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷有關(guān)的疾病(例如，阿耳茨海默病)的預(yù)防和治療劑。
本發(fā)明也提供使用THP-1細(xì)胞以ABCA1的表達(dá)為指標(biāo)篩選具有促進(jìn)HDL新生反應(yīng)作用的物質(zhì)的方法。
就是說，通過向?qū)HP-1細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)和分化得到的巨噬細(xì)胞中添加篩選對象物質(zhì)，測定細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的ABCA1的量，可以發(fā)現(xiàn)具有促進(jìn)HDL新生反應(yīng)作用的物質(zhì)。篩選對象物質(zhì)沒有特別限定，無論來自天然物的還是來自非天然物的都可以。另外ABCA1表達(dá)量的測定方法可以是一般的基因工程手法，例如可以采用下面敘述的實(shí)驗(yàn)例1或2給出的手法。
本發(fā)明的低HDL血癥改善劑以及動脈硬化預(yù)防和治療劑可以單獨(dú)給藥，優(yōu)選是以加入了藥劑學(xué)上容許的添加物后的制劑形式給藥。作為給藥途徑，可以采用口服和注射途徑。在上述制劑中，無論通過哪一種途徑給藥，都可以適當(dāng)使用從眾所周知的制劑添加物中選出來的成分(以下也稱為“制劑成分”)。具體的眾所周知的制劑添加物如可以從(1)醫(yī)藥品添加物手冊、丸善(株)、(1989)，(2)醫(yī)藥品添加物事典、第1版、(株)藥事日報社(1984)，(3)醫(yī)藥品添加物事典追補(bǔ)、第1版、(株)藥事日報社(1995)，和(4)藥劑學(xué)、改訂第5版、(株)南江堂(1997)記載的成分中按照給藥途徑和制劑用途適宜選擇。
例如，當(dāng)口服給藥時，作為上述添加物只要是作為可以構(gòu)成口服劑的制劑成分能夠達(dá)到本發(fā)明的目的的添加物無論什么樣的都可以，通?？梢赃x擇賦形劑、粘合劑、崩解劑、潤滑劑、包衣劑等眾所周知的制劑成分。作為具體的口服劑，如片劑、膠囊、顆粒劑、細(xì)粒劑、散劑、糖漿劑等。在該口服劑中也包括使用眾所周知的制劑成分，對作為有效成分的半胱氨酸蛋白酶抑制劑在體內(nèi)的釋放進(jìn)行控制的制劑(例如速釋性制劑、緩釋性制劑)。
另外當(dāng)注射給藥時，作為添加物可以使用可以構(gòu)成水性注射劑或非水性注射劑的制劑成分，通?？梢允褂萌芙鈩⑷芙庵鷦?、混懸劑、緩沖劑、穩(wěn)定劑、保存劑等眾所周知的制劑成分，也可以是構(gòu)成用于給藥時溶解或混懸后使用的粉末注射劑的眾所周知的制劑成分。作為水性注射劑的制劑成分；如注射用蒸餾水、等滲的滅菌水的鹽溶液(含有磷酸二氫鈉或磷酸氫二鈉、氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣或氯化鎂等，或含有這樣鹽的混合物)等。
本發(fā)明的低HDL血癥改善劑以及動脈硬化預(yù)防和治療劑的給藥量由于給藥的患者的年齡、體重、低HDL血癥或動脈硬化的癥狀、有無合并癥等而有所不同，可以進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整，通常口服給藥時，為1mg～3,000mg/日左右，或在注射給藥時，為0.1mg～1,000mg/日左右。
鑒于上述情況，也可理解為本發(fā)明提供該病癥或疾病的預(yù)防和/或治療法，其特征是將有效量的半胱氨酸蛋白酶抑制劑投給有低HDL血癥或動脈硬化癥危險因素的動物，另外還提供將有效量的半胱氨酸蛋白酶抑制劑與醫(yī)藥上容許的載體配合后用于制造低HDL血癥改善劑或由低HDL血癥改善劑構(gòu)成的動脈硬化預(yù)防和治療劑的半胱氨酸蛋白酶抑制劑的用途。而且，這些方法和用途可以根據(jù)上面敘述實(shí)施各個具體的方式。
實(shí)施例等以下，敘述實(shí)驗(yàn)例和制劑例，進(jìn)一步對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明，但本發(fā)明并不限定于這些例子。所有的例子等除了另外詳細(xì)敘述以外，都是使用標(biāo)準(zhǔn)的技術(shù)實(shí)施的，或可以實(shí)施的例子，這些對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是眾所周知的慣例。
試驗(yàn)例1 ALLN引起的增加ABCA1表達(dá)的作用<試驗(yàn)法>將THP-1細(xì)胞(人白血病細(xì)胞；American Type CultureCollection)在PMA(phorbol myristate acetate(佛波醇肉豆蔻酸酯醋酸酯)；和光純藥工業(yè)(株)制)存在下使用10％FBS-RPMI1640培養(yǎng)基(巖城硝子(株)制)72小時培養(yǎng)分化為巨噬細(xì)胞。將培養(yǎng)基換成添加了50μM ALLN(Sigma公司制)的0.2％BSA-RPMI1640(巖城硝子(株)制)，按照下述方法，隨時解析細(xì)胞內(nèi)ABCA1的表達(dá)量。
ALLN處理細(xì)胞和在沒有添加ALLN的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的對照細(xì)胞于5mM的Tris-HCl(pH8.5)中進(jìn)行低滲破碎后，經(jīng)離心(650g、5分鐘)，使核成分沉淀。對上清于105,000g離心30分鐘，回收全部膜成分。將全部膜成分溶解于0.9M尿素、0.2％triton X-100(和光純藥工業(yè)(株)制)、0.1％二硫代蘇糖醇溶液(和光純藥工業(yè)(株)制)后，加入4/1量的10％十二烷基硫酸鋰溶液(和光純藥工業(yè)(株)制)，使用10％SDS-7％聚丙烯酰胺凝膠(和光純藥工業(yè)(株)制)進(jìn)行電泳分離。將分離的蛋白固定和轉(zhuǎn)移到PVDF膜(Bio-Rad公司制)上后，用使用了抗人ABCA1兔抗體(利用通常的手法自己純化)的免疫印記技術(shù)對ABCA1蛋白的表達(dá)量進(jìn)行解析，對得到的該表達(dá)量的帶的濃度和大小用Scion Image(圖像解析軟件Scion公司制)讀出進(jìn)行數(shù)值化。
<結(jié)果>在添加了ALLN的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的THP-1細(xì)胞與對照細(xì)胞相比，可以確認(rèn)細(xì)胞內(nèi)的ABCA1的表達(dá)明顯增加。即，在圖1中給出了一直到添加ALLN后4小時的ABCA1表達(dá)增加作用，該增加作用從添加ALLN 15分鐘后就可看到，其強(qiáng)度將對照細(xì)胞(添加ALLN后的時間為0時間的細(xì)胞)ABCA1表達(dá)量作為100時，可以達(dá)到168～191。另外ABCA1表達(dá)增加作用即使在添加ALLN后24小時也可看到。
試驗(yàn)例2亮抑蛋白酶肽引起的ABCA1表達(dá)上升的作用用與試驗(yàn)例1同樣的方法，將THP-1細(xì)胞于代替ALLN而添加亮抑蛋白酶肽的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，與沒有經(jīng)亮抑蛋白酶肽處理的對照細(xì)胞進(jìn)行比較。結(jié)果，亮抑蛋白酶肽處理細(xì)胞與對照細(xì)胞相比，可以確認(rèn)細(xì)胞內(nèi)的ABCA1的表達(dá)明顯增加。圖2中給出了對照細(xì)胞(添加亮抑蛋白酶肽后的時間為0時間的細(xì)胞)和添加亮抑蛋白酶肽后7小時的ABCA1表達(dá)相對量。該亮抑蛋白酶肽引起的ABCA1增加作用即使在向培養(yǎng)基添加亮抑蛋白酶肽后24小時也可看到。
試驗(yàn)例3 ALLN引起的HDL新生反應(yīng)促進(jìn)作用<試驗(yàn)法>利用與Arakawa等人方法[J.Lipod Res.，41，1952-1962(2000)同樣的方法，使用THP-1細(xì)胞對基于依賴于apoA1的HDL新生反應(yīng)而轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)基中的膽固醇和磷脂量進(jìn)行解析，對添加了ALLN的細(xì)胞和沒有添加的細(xì)胞進(jìn)行比較。
<結(jié)果>添加了apoA1和ALLN的細(xì)胞中，與沒有添加apoA1和ALLN的細(xì)胞(對照組)和只添加apoA1的細(xì)胞(添加apoA1組)相比，確認(rèn)依賴于apoA1的膽固醇和磷脂轉(zhuǎn)運(yùn)出的量增加，即可看到HDL新生反應(yīng)促進(jìn)作用。圖3給出了該結(jié)果。
如上所述，通過上述試驗(yàn)確認(rèn)本發(fā)明的低HDL血癥改善劑不利用基因工程技術(shù)而表現(xiàn)出ABCA1表達(dá)增加作用，促進(jìn)HDL新生反應(yīng)。
上述本發(fā)明的半胱氨酸蛋白酶抑制劑引起的ABCA1表達(dá)增加作用在將半胱氨酸蛋白酶抑制劑添加到細(xì)胞培養(yǎng)基后，很快就可以看到，表明這并不是由于使用上述以往技術(shù)中的基因工程技術(shù)時那樣的ABCA1在細(xì)胞內(nèi)合成的亢進(jìn)得到的結(jié)果，暗示了是由于ABCA1的代謝抑制這一全新的機(jī)理造成的結(jié)果。
制劑例1本發(fā)明的半胱氨酸蛋白酶抑制劑100mg、乳糖100mg、玉米淀粉28mg、硬脂酸鎂2mg有關(guān)上述處方根據(jù)日本藥局方XIII的制劑總則記載的眾所周知方法可以得到膠囊劑。
制劑例2 將本發(fā)明的半胱氨酸蛋白酶抑制劑50mg溶解于由含有適量氯化鈉的注射用蒸餾水10ml配制的等滲水溶液，充填到安瓿瓶，密封后，滅菌，得到注射劑。
如上所述，以半胱氨酸蛋白酶抑制劑為有效成分的本發(fā)明的藥劑不用上述以往技術(shù)所見到的基因工程技術(shù)，通過與以往技術(shù)完全不同的機(jī)理可以使ABCA1的表達(dá)量增加，使血中HDL量增加，可以用作動脈硬化等多種疾病中出現(xiàn)頻率高的低HDL血癥的改善劑。另外本發(fā)明的低HDL血癥改善劑由于其低HDL血癥改善作用，也可以用作動脈硬化預(yù)防和治療劑。另外通過將半胱氨酸蛋白酶抑制劑給予具有患有低HDL血癥或患有動脈硬化的危險因素的動物等，可以進(jìn)行疾病的預(yù)防和治療。
本發(fā)明除了上述的說明和實(shí)施例中特別記述以外的可以實(shí)行是很清楚的。鑒于上述示范，本發(fā)明的很多的改變和變形是可能的，因此，這些也是本申請附加的權(quán)利范圍內(nèi)的內(nèi)容。
權(quán)利要求
1.以半胱氨酸蛋白酶抑制劑為有效成分的低HDL血癥改善劑。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的低HDL血癥改善劑，其中，半胱氨酸蛋白酶抑制劑來自天然物或非天然物。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的低HDL血癥改善劑，其中，來自天然物的半胱氨酸蛋白酶抑制劑是微生物、植物或動物來源的。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的低HDL血癥改善劑，其中，來源于微生物、植物或動物的半胱氨酸蛋白酶抑制劑是從亮抑蛋白酶肽、抗蛋白酶以及E-64中選出來的。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的低HDL血癥改善劑，來自非天然物的半胱氨酸蛋白酶抑制劑不是來源于微生物、植物或動物中的任一種，而是合成的物質(zhì)。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的低HDL血癥改善劑，其中，來自非天然物的半胱氨酸蛋白酶抑制劑是ALLN或N-乙酰leu-leu-蛋氨醛。
7.由權(quán)利要求1～6的任一項(xiàng)所述的低HDL血癥改善劑構(gòu)成的動脈硬化預(yù)防和治療劑。
8.具有促進(jìn)HDL新生反應(yīng)作用的物質(zhì)的篩選方法，使用THP-1細(xì)胞、以ABCA1的表達(dá)為指標(biāo)。
全文摘要
本發(fā)明涉及低HDL血癥改善劑。提供不需要基因工程技術(shù)、能針對HDL有用的低HDL血癥改善劑以及動脈硬化預(yù)防和治療劑，和該病癥的預(yù)防和治療法。提供通過將半胱氨酸蛋白酶抑制劑作為有效成分，不用基因工程技術(shù)而使ABCA1的表達(dá)量增加，使血中HDL增加，可在臨床上利用的低HDL血癥改善劑以及動脈硬化預(yù)防和治療劑。
文檔編號A61K38/56GK1568199SQ02820238
公開日2005年1月19日 申請日期2002年10月11日 優(yōu)先權(quán)日2001年10月12日
發(fā)明者橫山信治, 荒川禮二郎 申請人:格勒蘭制藥株式會社