專(zhuān)利名稱(chēng)：家蠅分泌型抗菌肽的分離方法及其產(chǎn)品和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種家蠅分泌型抗菌肽的分離方法及其產(chǎn)品和應(yīng)用，屬于昆蟲(chóng)抗菌肽的分離純化技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
昆蟲(chóng)每天都會(huì)直接接觸、食入、吸入成千上萬(wàn)的病原微生物而不至于患感染性疾病，這種抵抗外來(lái)致病微生物的能力主要是通過(guò)天然免疫的防御機(jī)制得以實(shí)現(xiàn)?？咕氖撬形锓N中天然防御機(jī)制的重要組成部分，這類(lèi)多肽可以是固有表達(dá)的，也可以被病原微生物及其產(chǎn)物誘導(dǎo)表達(dá)。
昆蟲(chóng)抗菌肽是一類(lèi)分子量小、水溶性好、穩(wěn)定、抗菌譜廣且抗菌機(jī)制獨(dú)特的多肽，是生物免疫系統(tǒng)產(chǎn)生的一類(lèi)抵抗外界病原體感染的物質(zhì)。不少科學(xué)家認(rèn)為，昆蟲(chóng)具有驚人的天然免疫力，并以抗菌肽作為其宿主防御機(jī)制的主要成分?？咕某蟹翘禺愋缘目共≡⑸锿?，還有抗腫瘤細(xì)胞的作用，而對(duì)人體的正常細(xì)胞無(wú)破壞作用。因此，抗菌肽的開(kāi)發(fā)和利用是目前抗病原微生物藥物開(kāi)發(fā)研究中的一個(gè)熱點(diǎn)。
家蠅是重要的醫(yī)學(xué)昆蟲(chóng)，能夠機(jī)械傳播人、畜多種病原菌如細(xì)菌、病毒和寄生蟲(chóng)卵等。目前國(guó)內(nèi)外報(bào)道已從其幼蟲(chóng)血淋巴中分離到了多種抗細(xì)菌、真菌、原蟲(chóng)的生物活性抗菌蛋白/多肽，在幼蟲(chóng)體外分泌物中發(fā)現(xiàn)了廣譜的抗植物病原菌、植物根結(jié)線蟲(chóng)及寄生蟲(chóng)卵的物質(zhì)。但這些研究多集中于抗菌肽的誘導(dǎo)及活性檢測(cè)階段，而體外不同環(huán)境對(duì)其抗菌活性的影響均無(wú)報(bào)道。目前，抗菌肽的純化方法多使用性質(zhì)溫和的凝膠層析，但該方法所需時(shí)間較長(zhǎng)，每次上樣量及目的蛋白的回收量較小。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種家蠅分泌型抗菌肽的分離方法及其產(chǎn)品和應(yīng)用。本發(fā)明采用透析、固相萃取、超濾和反相高效液相色譜方法從家蠅幼蟲(chóng)分泌物中分離到具廣譜抗菌活性的肽類(lèi)物質(zhì)，使抗菌肽制備時(shí)間縮短，提高了分離純化的效率，而且該抗菌肽在體外不同的環(huán)境中其抗菌活性具有較強(qiáng)的穩(wěn)定性，可通過(guò)破壞細(xì)菌細(xì)胞膜通透性、抑制細(xì)菌體分裂、阻礙與細(xì)胞分裂相關(guān)的某些蛋白質(zhì)的合成等途徑發(fā)揮抗菌作用；具有提高特異性和非特異性免疫功能的作用，對(duì)細(xì)菌感染有一定的保護(hù)作用。
本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的家蠅分泌型抗菌肽的分離方法為將抗菌肽粗提液進(jìn)行透析，透析內(nèi)液經(jīng)固相萃取，洗脫組分經(jīng)超濾分離，活性組分進(jìn)一步用反相高效液相色譜純化出兩個(gè)抗菌活性組分，即得家蠅分泌型抗菌肽。
所述的抗菌肽粗提液，即家蠅幼蟲(chóng)外分泌物粗提液的制備為取三齡家蠅幼蟲(chóng)置于干凈大燒杯中，充分清潔體表后浸于適量蒸餾水中4小時(shí)，不時(shí)振搖；吸取浸液離心10000g×10min，上清液冷凍干燥濃縮，即得抗菌肽粗提液，4℃保存?zhèn)溆谩?br> 具體的分離方法為(1)透析將濃縮的抗菌肽粗提液用截留分子量為3500道爾頓的透析袋透析過(guò)夜，其間換掉外液兩次；取內(nèi)液用0.22μm的無(wú)菌濾器過(guò)濾除菌，-20℃保存?zhèn)溆茫?2)固相萃取取透析后抗菌肽粗提液上Sep-pak C18Cartridge固相萃取小柱，依次用5ml含0％～80％甲醇的0.05％三氟乙酸(TFA)溶液分步洗脫，流速為1ml/min；各洗脫組分冷凍干燥除掉甲醇(ACN)和三氟乙酸(TFA)后，超純水溶解，檢測(cè)該洗脫組分的抗菌活性；收集、濃縮、凍干具有活性的組分，超純水溶解，12000rpm離心10min，收集上清液-20℃保存?zhèn)溆茫?3)超濾將固相萃取活性組分合并后加到截留分子量為3KD的超濾管中，5000×g離心30min分離；繼續(xù)將未透過(guò)超濾管的組分加到截留分子量為30KD的超濾管中，同上離心，分別收集超濾管中和管下液體，將活性物質(zhì)分為三個(gè)部分分子量＞30KD、3～30KD、＜3KD，取各組分檢測(cè)蛋白濃度和抗菌活性；(4)反相高效液相色譜純化超濾后活性組分用0.22μm微孔濾膜過(guò)濾，100μl上C18反相色譜柱，流動(dòng)相A0.1％三氟乙酸(TFA)-水溶液；B0.1％三氟乙酸(TFA)-甲醇(ACN)溶液；色譜柱用5％甲醇(CAN)-0.1％三氟乙酸(TFA)溶液平衡，洗脫條件為梯度洗脫，30min內(nèi)己腈濃度從5％上升到60％流速1ml/min，手工收集214nm波長(zhǎng)洗脫峰，即獲得兩個(gè)抗菌肽組分。
以上所用的Sep-pak C18Cartridge固相萃取小柱在加樣前預(yù)用4ml甲醇活化、4ml0.05％三氟乙酸-水平衡；所用的C18反相色譜柱為Beckman，System Gold，U.S.A.，ODS 0.5μm，0.46×25cm。
上述家蠅分泌型抗菌肽的分離方法分離得到的家蠅分泌型抗菌肽。
上述家蠅分泌型抗菌肽在制備提高特異性或非特異性免疫功能、抗細(xì)菌感染的藥物或保健品中的應(yīng)用。
上述家蠅分泌型抗菌肽在動(dòng)物飼料或防腐劑中的應(yīng)用。
本發(fā)明以家蠅幼蟲(chóng)體外分泌物為原料，采用現(xiàn)代分離純化技術(shù)，對(duì)幼蟲(chóng)外分泌型抗菌肽的分離、純化及其性質(zhì)進(jìn)行了研究，并初步探討了該抗菌肽的抑菌機(jī)理。同時(shí)，將抗菌肽應(yīng)用于正常和感染小鼠，研究其對(duì)小鼠免疫功能、血液生化指標(biāo)及重要器官病理變化的影響，為昆蟲(chóng)抗菌肽的開(kāi)發(fā)及應(yīng)用提供了理論基礎(chǔ)。
一、本發(fā)明抗菌肽的分離純化發(fā)明人通過(guò)研究摸索到一條純化時(shí)間短、蛋白質(zhì)得率高、抗菌活性穩(wěn)定及活性較好的抗菌肽提取路線首先用截留分子量為3500道爾頓的透析袋透析除掉粗提液中的鹽及小分子雜質(zhì)，透析內(nèi)液進(jìn)一步用0％-80％的甲醇進(jìn)行固相萃取梯度洗脫，洗脫組分冷凍干燥濃縮，再經(jīng)30KD超濾管超濾處理，除掉大分子的無(wú)活性成分，余下組分進(jìn)一步用C18反相高效液相色譜純化，最終在15.5min和18.5min處得到兩個(gè)活性蛋白峰，紫外吸收光譜分析證明為蛋白肽類(lèi)物質(zhì)。整個(gè)純化過(guò)程純化倍數(shù)為27.93倍，活性回收率9.62％。
抗菌肽常常存在于胞漿顆粒中，其分子量較低。一般而言，提取多肽樣品的方法主要有水浸提法、有機(jī)溶劑抽提法和有機(jī)酸抽提法等。本研究采用的抗菌肽提取方法是基于發(fā)明人的長(zhǎng)期摸索，將幾種純化方法進(jìn)行詳細(xì)比較以后得到的較為成熟和簡(jiǎn)便的方法。
首先，考慮到家蠅幼蟲(chóng)分泌物粗提液中除了其分泌的抗菌肽以外，還有許多腸道的一些內(nèi)容物、鹽類(lèi)和其他小分子物質(zhì)，因此，我們利用截留分子量為3500D的透析袋將粗提液進(jìn)行透析，以此除掉小分子的雜質(zhì)和鹽類(lèi)等物質(zhì)。固相萃取是目前對(duì)生物分子分離的一種常用方法，本發(fā)明使用的是Sep-Pak C18Cartridge柱，該柱能減少樣品制備的時(shí)間，操作簡(jiǎn)便，快捷。可完成純化、樣品富積或濃縮、分級(jí)分離及溶劑交換等工作。在樣品的分級(jí)分離中，根據(jù)分析物極性的不同，采用梯度增加溶劑強(qiáng)度的辦法，選擇性地洗脫和分離分析物。透析以后的幼蟲(chóng)分泌物經(jīng)固相萃取后，0％、10％、20％、30％組分固體培養(yǎng)法和液體培養(yǎng)法均沒(méi)有顯示抗菌活性，而40％-50％組分活性弱且不穩(wěn)定，僅60％～80％組分具有較強(qiáng)抗菌活性，而且活性非常穩(wěn)定。發(fā)明人前期在摸索固相萃取條件的同時(shí)也采用凝膠層析的老方法來(lái)分離分泌物抗菌肽，但綜合比較，效果始終不如固相萃取好，主要是后者所需時(shí)間長(zhǎng)，層析后樣品還需要脫鹽，而且活性的穩(wěn)定性也沒(méi)有萃取高，因此，本發(fā)明最終選擇了固相萃取來(lái)分離抗菌肽。
超濾是一種膜分離的單元操作，它是利用膜的選擇性，溶液各組分透過(guò)膜的遷移率不同而分離，在分離中被傳遞的是溶劑，屬于速率控制的傳質(zhì)過(guò)程，具有操作方便，無(wú)相變，無(wú)化學(xué)變化，處理效率高和節(jié)能等優(yōu)點(diǎn)。發(fā)明人將萃取活性組分合并后，分步使用截留分子量為3KD和30KD的超濾管，發(fā)現(xiàn)活性組分分子量介于3-30KD間，符合前人研究的結(jié)論。
高效液相色譜在生物分子的分離純化中具有獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)，為生物分子的分離分析提供了良好的生物兼容性，對(duì)復(fù)雜混合物的分離能力強(qiáng)。其分辨率極高，固定相是帶有多孔的微小硅膠顆粒的表面固定上了非極性的C-8或C-18非極性基團(tuán)，流動(dòng)相用極性溶液如己腈、甲醇、水或低鹽緩沖液等。被分離組分中極性強(qiáng)的大分子物質(zhì)首先被洗脫，小分子物質(zhì)后被洗脫，而極性小的物質(zhì)則保留時(shí)間較長(zhǎng)?？咕膶儆跇O性物質(zhì)，易于分配在極性流動(dòng)相中。
發(fā)明人用瓊脂擴(kuò)散法和活菌計(jì)數(shù)法對(duì)本發(fā)明所提取的抗菌肽活性進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，該抗菌肽對(duì)條件致病菌如大腸桿菌、致病菌如金黃色葡萄球菌有抑制作用，而且對(duì)非條件治病菌枯草芽孢桿菌也有抑制作用，對(duì)標(biāo)準(zhǔn)菌株和臨床分離菌株的抗菌活性無(wú)明顯差異，提示其對(duì)致病菌和非致病菌的抑制作用可能沒(méi)有選擇性。從抑菌結(jié)果來(lái)看，首先該抗菌肽對(duì)消化道感染菌大腸埃希菌有抑制作用，提示此抗菌肽類(lèi)物質(zhì)可能有治療大腸埃希菌性消化道疾病及調(diào)節(jié)消化道內(nèi)菌群平衡的作用；其次，它對(duì)外傷感染菌如金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌等有抑制作用，提示其可以用于預(yù)防和治療禽畜外傷感染，促進(jìn)傷口愈合。在抗菌肽對(duì)多種細(xì)菌的抗菌效果檢測(cè)中，可以看出對(duì)于同種不同株的細(xì)菌，作用效果基本相同，但總體而言，該抗菌肽對(duì)革蘭氏陰性菌的抗菌效果要好于革蘭氏陽(yáng)性菌。據(jù)研究，大多已報(bào)道的抗菌肽對(duì)革蘭氏陰性菌(G-)的抗菌效果強(qiáng)于革蘭氏陽(yáng)性菌(G+)，這是由于大多數(shù)抗菌肽屬于中性或偏堿性蛋白，能通過(guò)與G-菌外膜上的脂多糖等負(fù)電物質(zhì)相互作用，從而破壞膜結(jié)構(gòu)以發(fā)揮抗菌作用。而G+菌沒(méi)有脂多糖膜，只能通過(guò)表面肽聚糖中的胞壁酸、糖醛酸等帶少量負(fù)電荷。本發(fā)明提取的抗菌肽對(duì)G-的抗菌效果優(yōu)于G+，推測(cè)亦屬于中性或偏堿性蛋白。
銅綠假單細(xì)胞菌、大腸埃希氏菌、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)等是臨床上最常見(jiàn)的病原菌，易產(chǎn)生抗藥性而導(dǎo)致臨床難治性感染。對(duì)家蠅抗菌肽進(jìn)行開(kāi)發(fā)利用之后，將會(huì)對(duì)臨床抗感染治療，特別是對(duì)耐藥菌感染的治療發(fā)揮重要作用，同時(shí)也必將產(chǎn)生巨大的社會(huì)效益和經(jīng)濟(jì)效益。
二、本發(fā)明抗菌肽的生化特性發(fā)明人參照Hermann Schagger等(1987)和吳冠蕓等的方法進(jìn)行Tris-TricineSDS-PAGE，檢測(cè)了本發(fā)明分離純化所得提純物的純度。以分子量2,512、6,210、8,159、10,700、14,404、16,949Da為標(biāo)準(zhǔn)蛋白，先測(cè)定各種標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的電泳相對(duì)遷移率(Rf)，然后以各種標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)分子量的對(duì)數(shù)為縱坐標(biāo)，其Rf值為橫坐標(biāo)，作圖得到標(biāo)準(zhǔn)曲線。最后，測(cè)出未知蛋白的Rf值，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出該蛋白質(zhì)的分子量。
首先用低分子量的Mark來(lái)檢測(cè)抗菌活性物質(zhì)的純度，發(fā)現(xiàn)在標(biāo)準(zhǔn)最低分子量(14.4KD)條帶稍下有一清晰蛋白條帶，分子量小于14.4KD?？紤]到目的蛋白的分子量偏小，又選用超低分子量Mark再次電泳，發(fā)現(xiàn)該活性組分的主要成分確實(shí)在14.4KD稍下，但同時(shí)，在8,159D和6,210D間出現(xiàn)了一條顏色較淺的條帶，蛋白含量明顯低于上一條帶。該現(xiàn)象提示，經(jīng)60％-80％甲醇洗脫得到的抗菌活性組分，主要蛋白的分子量為14.4KD以下，即抗菌活性成分不是單一物質(zhì)。測(cè)定上述電泳凝膠中各種標(biāo)準(zhǔn)多肽的電泳相對(duì)遷移率(Rf)，然后以各種標(biāo)準(zhǔn)多肽分子量的對(duì)數(shù)為縱坐標(biāo)，其Rf值為橫坐標(biāo)，作圖可得到標(biāo)準(zhǔn)曲線。同樣方法測(cè)得家蠅幼蟲(chóng)分泌物抗菌肽的Rf分別為0.7467和0.9067。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(y＝-1.6959x+5.4173，R＝0.9899)，計(jì)算其分子量分別為14157D和7579D。
抗菌肽的胰蛋白酶水解片段的質(zhì)譜分析結(jié)果電泳條帶上抗菌肽I經(jīng)胰蛋白酶水解后，被水解成38個(gè)肽段，應(yīng)用肽指紋圖譜技術(shù)，對(duì)酶解后隨機(jī)選擇的片段進(jìn)行質(zhì)譜分析。通過(guò)Mascot查詢(xún)NCBInr數(shù)據(jù)庫(kù)，該抗菌肽與溶菌酶的前體(登陸號(hào)qi47117014)的氨基酸序列有一定的同源性，但序列覆蓋率僅為20％，且兩者分子量有明顯差異，質(zhì)譜測(cè)定抗菌肽I的精確分子量為14264D，而后者(抗菌肽II)分子量為16179D。
抗菌肽I水解后的肽段1為K.SQQGWTAWSTWK.YLys.Ser-Gln-Gln-Gly-Trp-Thr-Ala-Trp-Ser-Thr-Trp-Lys.Tyr賴(lài)氨酸.絲氨酸-谷胺酰胺-谷胺酰胺-甘氨酸-色氨酸-蘇氨酸-丙氨酸-色氨酸-絲氨酸-蘇氨酸-色氨酸-賴(lài)氨酸.酪氨酸肽段2為K.SELPQWTCIAEHESSYR.TLys.Ser-Glu-Leu-Pro-Gln-Trp-Thr-Cys-Ile-Ala-Glu-His-Glu-Ser-Ser-Tyr-Arg.Thr賴(lài)氨酸.絲氨酸-谷氨酸-亮氨酸-脯氨酸-谷胺酰胺-色氨酸-蘇氨酸-半胱氨酸-異亮氨酸-丙氨酸-谷氨酸-組氨酸-谷氨酸-絲氨酸-絲氨酸-酪氨酸-精氨酸.蘇氨酸抗菌肽I中的其余肽段和抗菌肽II中的肽段正在進(jìn)一步地研究、測(cè)試之中。
通過(guò)檢測(cè)抗菌肽的抑菌譜，試管稀釋法測(cè)定對(duì)多株細(xì)菌的最低抑菌濃度(MIC)及最低殺菌濃度(MBC)；觀察在不同pH值、陽(yáng)離子濃度、動(dòng)物血清環(huán)境中抗菌肽活性的變化；檢測(cè)抗菌肽的凝血及溶血效應(yīng)。結(jié)果表明家蠅分泌型抗菌肽對(duì)多株革蘭氏陽(yáng)性和陰性菌均有很好的抗菌效果，對(duì)標(biāo)準(zhǔn)菌株大腸埃希菌、傷寒沙門(mén)氏菌、痢疾桿菌、枯草芽孢桿菌的MIC是32.74μg/ml，對(duì)銅綠色假單胞菌的MIC為16.37μg/ml，對(duì)金黃色葡萄球菌、藤黃微球菌的MIC為65.48μg/ml。其在中性至弱堿性(pH6-9)條件下抗菌活性較好；一價(jià)和二價(jià)陽(yáng)離子對(duì)抗菌活性無(wú)明顯影響；該抗菌肽在體外既無(wú)凝血效應(yīng)亦無(wú)溶血效應(yīng)。
三、本發(fā)明抗菌肽的體外抗菌機(jī)理通過(guò)觀察抗菌肽在最小抑菌濃度(MIC)下大腸埃希菌(ATCC 25922)生長(zhǎng)曲線、胞內(nèi)酶含量及菌體蛋白質(zhì)SDS-PAGE圖譜的變化；透射電鏡觀察抗菌肽形態(tài)變化；流式細(xì)胞儀對(duì)菌體細(xì)胞周期進(jìn)行分析。結(jié)果提示抗菌肽對(duì)大腸埃希菌的抑菌機(jī)理可能是1、改變細(xì)菌細(xì)胞膜的通透性；2、抑制調(diào)控細(xì)菌生長(zhǎng)、分裂相關(guān)蛋白的合成，阻礙其分裂和生長(zhǎng)。
四、本發(fā)明抗菌肽對(duì)小鼠免疫功能的影響檢測(cè)巨噬細(xì)胞功能和胸腺、脾臟重量是觀察藥物對(duì)整體免疫影響的重要指標(biāo)。發(fā)明人在對(duì)家蠅幼蟲(chóng)分泌物抗菌肽體外抗菌實(shí)驗(yàn)有效的前提下，檢測(cè)了抗菌肽體內(nèi)對(duì)小鼠免疫功能的影響，為進(jìn)一步探明抗菌肽在天然免疫中的作用提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
為探討抗菌肽對(duì)正常小鼠免疫功能的影響，以小白鼠為試驗(yàn)動(dòng)物，分別采用不同濃度(5mg/kg、10mg/kg、20mg/kg)研究了抗菌肽對(duì)小白鼠免疫器官指數(shù)、非特異性免疫功能和特異性免疫功能的影響。結(jié)果表明1、10mg/kg.d和20mg/kg.d的抗菌肽量對(duì)小鼠體重?zé)o明顯影響，但對(duì)胸腺和脾臟生長(zhǎng)有一定的促進(jìn)作用，其中，中、高劑量組明顯高于對(duì)照組。說(shuō)明抗菌肽能促進(jìn)免疫器官的生長(zhǎng)，提高免疫器官指數(shù)。2、腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞和碳粒廓清實(shí)驗(yàn)中，抗菌肽中、高劑量組巨噬細(xì)胞吞噬指數(shù)、吞噬百分?jǐn)?shù)及小鼠碳粒廓清指數(shù)均明顯高于對(duì)照組。說(shuō)明抗菌肽具有提高小鼠機(jī)體的非特異性免疫的功能。3、抗菌肽中、高劑量能增強(qiáng)ConA誘導(dǎo)的小鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率、二硝基氟苯(DNFB)誘導(dǎo)的遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)(DTH)等細(xì)胞免疫功能來(lái)提高機(jī)體的特異性防御能力。
(一)抗菌肽的安全性評(píng)價(jià)以小白鼠為試驗(yàn)動(dòng)物，采用改良寇氏法，計(jì)算該抗菌肽的半數(shù)致死量(LD50)，但最大給藥量為200mg/kg.d動(dòng)物均無(wú)中毒及死亡現(xiàn)象，提示該劑量下抗菌肽為基本無(wú)毒。以實(shí)驗(yàn)兔為對(duì)象，采用熱源性試驗(yàn)法和刺激性試驗(yàn)法對(duì)抗菌肽進(jìn)行熱原和刺激性檢查，結(jié)果表明，該抗菌肽無(wú)熱源性和刺激性，以腹腔注射方法給藥是安全的。
(二)抗菌肽對(duì)小鼠非特異性免疫功能的影響1.抗菌肽對(duì)小鼠體重及免疫器官指數(shù)的影響抗菌肽低劑量組(5mg/kg)小鼠的脾臟指數(shù)、胸腺指數(shù)與對(duì)照組相比，分別提高了5％和18％，體重降低了3％，但無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。中劑量組和高劑量組(10mg/kg和20mg/kg)小鼠的脾臟指數(shù)、胸腺指數(shù)與對(duì)照組相比明顯增高，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)，差異有顯著性(P＜0.05)，即抗菌肽對(duì)小鼠的胸腺、脾臟有一定的促生長(zhǎng)作用，能明顯提高小鼠的免疫器官重量，此作用有一定的量效關(guān)系，隨著用量增加而重量增加。實(shí)驗(yàn)組小鼠的體重較對(duì)照組稍低一些，尤其是實(shí)驗(yàn)組I，但采用配對(duì)T檢驗(yàn)對(duì)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的體重進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)，得P＞0.05，故抗菌肽低、中、高劑量組小鼠的體重與對(duì)照組相比無(wú)顯著性差異。

2.抗菌肽對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響由下表可知，抗菌肽低劑量對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞的能力沒(méi)有提升作用，但中、高劑量則可明顯提高腹腔巨噬細(xì)胞的吞噬百分?jǐn)?shù)、吞噬指數(shù)。同時(shí)，低、中、高劑量的抗菌肽均能提高小鼠的碳粒廓清指數(shù)K和α，其中，以中、高劑量組效果較為明顯。
抗菌肽對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞吞噬能力的影響

抗菌肽對(duì)小鼠碳粒廓清活性的影響

*表示與生理鹽水組比較差異顯著性(P＜0.05)，**表示與生理鹽水組比較差異極顯著(P＜0.01)。
3.抗菌肽對(duì)脾臟ACP活性的影響抗菌肽低劑量組小鼠脾臟ACP活性為213.75±29.27，對(duì)照組為186.66±17.16兩組相比P＞0.05，沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。中高劑量抗菌肽組小鼠脾臟ACP活性分別為268.60±36.64和270.48±54.63，與對(duì)照組及低劑量組相比，P值均＜0.05，差異有顯著性。提示中高劑量的抗菌肽作用后，能提高小鼠脾臟ACP的活性。
4.抗菌肽對(duì)小鼠血清溶菌酶活性的影響抗菌肽對(duì)小鼠血清溶菌酶含量的影響

(三)抗菌肽對(duì)小鼠特異性免疫功能的影響1.實(shí)驗(yàn)結(jié)果1.1抗菌肽對(duì)小鼠脾T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率的影響經(jīng)ConA誘導(dǎo)的小鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，抗菌肽低、中、高劑量組能顯著增強(qiáng)ConA誘導(dǎo)的脾淋巴細(xì)胞增殖能力(見(jiàn)下表)，其中以中、高劑量組增強(qiáng)效果較好，提示5-20mg/kg的抗菌肽對(duì)小鼠細(xì)胞免疫功能均有增強(qiáng)作用。
抗菌肽對(duì)小鼠脾T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率的影響

1.2利用耳腫脹法測(cè)定了二硝基氟苯(DNFB)對(duì)遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)(DTH)的誘導(dǎo)作用，結(jié)果表明抗菌肽中高劑量組顯著增強(qiáng)小鼠對(duì)DNFB誘發(fā)的DTH反應(yīng)(見(jiàn)下表)。
抗菌肽對(duì)DNFB致小鼠DTH反應(yīng)的影響

1.3抗菌肽對(duì)小鼠血清溶血素的影響結(jié)果見(jiàn)表，各實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組間血清溶血素比較差異沒(méi)有顯著性，提示抗菌肽的使用對(duì)小鼠血清溶血素沒(méi)有明顯影響。
抗菌肽對(duì)小鼠血清溶血素的影響

2結(jié)論2.1免疫器官指數(shù)脾臟和胸腺是動(dòng)物的重要免疫器官。由于機(jī)體內(nèi)的免疫細(xì)胞大多數(shù)分布于胸腺和脾臟中，成年動(dòng)物的胸腺重量逐漸下降。因此，脾臟與胸腺重量增高，則相對(duì)的表明機(jī)體的免疫功能增強(qiáng)。胸腺是產(chǎn)生免疫的中樞淋巴器官，是T淋巴細(xì)胞分化成熟的場(chǎng)所，T淋巴細(xì)胞主要參與機(jī)體的細(xì)胞免疫功能，在機(jī)體自身穩(wěn)定和免疫監(jiān)視中起主導(dǎo)作用。脾臟是體內(nèi)最大的淋巴器官，其免疫細(xì)胞中以B淋巴細(xì)胞為主(約占50％-60％)，B淋巴細(xì)胞主要參與體液免疫。此外，脾臟還能清除自身衰老的血細(xì)胞和免疫復(fù)合物。免疫器官的重量在一定程度上可以反映器官內(nèi)淋巴細(xì)胞的數(shù)量，從而間接了解體內(nèi)淋巴細(xì)胞的總體水平。如果兩者的系數(shù)都增加，說(shuō)明藥物對(duì)細(xì)胞免疫和體液免疫都有促進(jìn)作用。
本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，抗菌肽中高劑量對(duì)小鼠的免疫器官指數(shù)均有明顯的增高，從一定程度上反映了本發(fā)明抗菌肽可以增強(qiáng)動(dòng)物的免疫功能。從不同劑量的抗菌肽作用結(jié)果來(lái)看，抗菌肽的增強(qiáng)免疫作用有一定劑量依賴(lài)性，低劑量效果不明顯，隨著劑量的增加，免疫器官指數(shù)增高明顯，但并非高劑量效果總是強(qiáng)于中劑量。
2.2巨噬細(xì)胞吞噬功能巨噬細(xì)胞是一種非特異性免疫細(xì)胞，它能吞噬和消滅外來(lái)異物及自身衰老死亡的細(xì)胞。此外，它在免疫反應(yīng)中還起到了處理抗原，傳遞抗原信息，調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)等重要作用。巨噬細(xì)胞功能的測(cè)定采用對(duì)碳粒廓清吞噬能力和吞噬雞紅細(xì)胞能力的檢測(cè)。
碳粒廓清能力的大小是評(píng)價(jià)機(jī)體非特異免疫功能重要指標(biāo)。吞噬顆粒狀異物是單核-巨噬細(xì)胞系統(tǒng)的重要功能。肝臟和脾臟是執(zhí)行此功能的主要器官，肝枯否氏細(xì)胞占吞噬量的90％，脾臟細(xì)胞占10％左右。向血液中注射一定量的碳粒懸液，其在血液中的清除速率反映了本系統(tǒng)細(xì)胞吞噬功能的狀態(tài)。在一定濃度范圍內(nèi)，碳粒的清除速率與其劑量呈指數(shù)函數(shù)關(guān)系，即吞噬速率與血碳濃度成正比，而與已吞噬的碳顆粒成反比。廓清指數(shù)K反映的是碳粒清除速率。而單核-巨噬細(xì)胞系統(tǒng)一旦被激活，常伴有肝、脾Mφ增生，吞噬指數(shù)α以單位重量組織的吞噬活性為評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，排除了增生因素的影響，只評(píng)價(jià)吞噬細(xì)胞功能的活躍程度。小鼠尾靜脈注射印度墨汁，其碳粒迅速被肝、脾等器官內(nèi)皮網(wǎng)狀內(nèi)皮細(xì)胞吞噬而使其血漿濃度下降，因此其廓清率間接反映單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)的的吞噬功能。
本研究的結(jié)果顯示，抗菌肽中高劑量可以明顯提高小鼠的廓清指數(shù)，而低劑量組雖然對(duì)吞噬雞紅細(xì)胞能力有所提高，但與對(duì)照組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)上的意義(P＞0.05)。小鼠碳粒廓清實(shí)驗(yàn)和腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，雖然都能反應(yīng)機(jī)體免疫系統(tǒng)的吞噬功能，但因二者實(shí)驗(yàn)方法不同，免疫作用的場(chǎng)所也不一樣，被吞噬異物的種類(lèi)不同，引起吞噬細(xì)胞游走及殺滅異物的機(jī)理也不同，本實(shí)驗(yàn)中兩者結(jié)果基本相符，提示抗菌肽可以增強(qiáng)小鼠的非特異性免疫功能。
2.3脾臟ACP的活性巨噬細(xì)胞消化率的強(qiáng)弱，主要由巨噬細(xì)胞內(nèi)溶酶體數(shù)量及其幾十種酶含量的多少來(lái)決定，其中，酸性磷酸酶(ACP)是溶酶體的標(biāo)志酶，在消化異物及細(xì)胞代謝方面起著重要作用。ACP活性的增強(qiáng)是巨噬細(xì)胞激活的一個(gè)主要標(biāo)志。增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的吞噬消化功能，就意味著提高機(jī)體的非特異性免疫力。巨噬細(xì)胞與淋巴細(xì)胞關(guān)系密切，前者具有攝取抗原的功能，而后者不易直接攝取抗原，通過(guò)巨噬細(xì)胞來(lái)傳遞抗原的免疫信息。因此，巨噬細(xì)胞在機(jī)體抵抗病原入侵的過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，其處理抗原作用的強(qiáng)弱，可影響到機(jī)體的特異性免疫。
脾臟是機(jī)體最大的淋巴器官，其中的巨噬細(xì)胞來(lái)源于骨髓中的髓樣干細(xì)胞，通過(guò)血流不斷流入，稱(chēng)為游走和固定巨噬細(xì)胞。血液中的單核細(xì)胞進(jìn)入脾臟，在局部微環(huán)境的影響下分化成熟，成為巨噬細(xì)胞。巨噬細(xì)胞體積增大，細(xì)胞表面脊?fàn)钔黄鹪龆啵麅?nèi)有完善的細(xì)胞器，且溶酶體、線粒體增多，通過(guò)吞噬和細(xì)胞內(nèi)殺傷而發(fā)揮抗感染作用，但只有活化的巨噬細(xì)胞才有強(qiáng)大的殺滅能力。本實(shí)驗(yàn)選擇了脾臟中的標(biāo)志酶ACP的活性來(lái)觀察巨噬細(xì)胞活性的高低，從而進(jìn)一步估計(jì)機(jī)體非特異性免疫功能的強(qiáng)弱。
本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，中劑量和高劑量的抗菌肽對(duì)正常小鼠脾臟ACP活性均顯著提高，分別比對(duì)照組提高了43％和44％，說(shuō)明二者都能增強(qiáng)正常小鼠脾臟中巨噬細(xì)胞的活性，從而促進(jìn)小鼠的非特異性免疫功能。
2.4溶菌酶的活力小鼠巨噬細(xì)胞吞噬的外源性物質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)消化分解主要是依靠胞內(nèi)的酶系統(tǒng)來(lái)完成，溶菌酶就是這個(gè)酶系統(tǒng)中具有重要作用的酶之一。
小鼠經(jīng)卡介苗(BCG)免疫后血清溶菌酶水平明顯升高，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，血清溶菌酶活性達(dá)高峰時(shí)，經(jīng)金黃色葡萄球菌感染的小鼠死亡率最低，說(shuō)明血清溶菌酶水平同抗感染力有一定的關(guān)系。溶菌酶除了在抗菌方面有重要作用外，還能夠激活單核細(xì)胞，增加PMNS和巨噬細(xì)胞的吞噬功能及巨噬細(xì)胞的抗原呈遞功能。
因此，本發(fā)明家蠅幼蟲(chóng)分泌物抗菌肽增強(qiáng)吞噬細(xì)胞的吞噬功能可能是多種原因綜合作用的結(jié)果，其途徑可能是①激活巨噬細(xì)胞；②促進(jìn)功能細(xì)胞分泌溶菌酶；③提高溶菌酶的活性等。
2.5脾T淋巴細(xì)胞增殖能力脾臟是機(jī)體最大的外周免疫器官，也是T、B淋巴細(xì)胞定居和接受抗原刺激產(chǎn)生免疫應(yīng)答的重要場(chǎng)所，以刀豆蛋白A(ConA)為代表的有絲分裂原能非特異性的誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞活化，導(dǎo)致細(xì)胞因子合成，細(xì)胞因子受體表達(dá)及最終活化增殖。T淋巴細(xì)胞在體外培養(yǎng)過(guò)程中受ConA等刺激后，可出現(xiàn)代謝旺盛、蛋白質(zhì)和核酸合成增加，進(jìn)而轉(zhuǎn)化為較大的淋巴母細(xì)胞。轉(zhuǎn)化率的高低反應(yīng)機(jī)體細(xì)胞免疫水平。ConA誘導(dǎo)的小鼠淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)中，T淋巴細(xì)胞受ConA刺激后發(fā)生母細(xì)胞轉(zhuǎn)化，活細(xì)胞特別是增殖細(xì)胞通過(guò)線粒體水解酶可將MTT(一種淡黃色的唑氮鹽)分解為藍(lán)紫色結(jié)晶而顯色，其光密度值的變化能反應(yīng)細(xì)胞的增殖情況。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，各劑量組都有不同程度的提高T淋巴細(xì)胞增殖能力的作用，以中高劑量組效果較明顯。
2.6遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)即T淋巴細(xì)胞受抗原刺激后，分化為特異性的致敏淋巴細(xì)胞，當(dāng)有相同抗原再次侵入時(shí)，引起局部致敏淋巴細(xì)胞釋放出多種淋巴因子，導(dǎo)致以單核細(xì)胞浸潤(rùn)為主的炎癥反應(yīng)，表現(xiàn)為皮膚紅腫，硬結(jié)。炎癥反應(yīng)的程度可以衡量機(jī)體對(duì)該抗原特異性細(xì)胞免疫力的大小。
2.7血清溶血素的測(cè)定血清溶血素是檢測(cè)機(jī)體體液免疫功能的一個(gè)指標(biāo)，是抗體生成細(xì)胞檢測(cè)試驗(yàn)之一。用抗原(SRBC)免疫動(dòng)物后，B淋巴細(xì)胞受到SRBC刺激后，分化為漿細(xì)胞，漿細(xì)胞產(chǎn)生抗SRBC抗體(溶血素)，當(dāng)再次與SRBC一起孵育，在補(bǔ)體的參與下，可使羊紅細(xì)胞發(fā)生溶血反應(yīng)，并釋放血紅蛋白。Yasuji等從中國(guó)柞蠶中提取的抗菌肽D，能促進(jìn)鼠造血細(xì)胞的生長(zhǎng)、功能與分化作用，還能調(diào)節(jié)淋巴細(xì)胞DNA的合成，以及粒性白細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的群體形成，也能應(yīng)能影響B(tài)細(xì)胞抗體的產(chǎn)量。
本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，抗菌肽對(duì)小鼠血清溶血素的含量沒(méi)有明顯的影響。
總結(jié)上述結(jié)果，本發(fā)明家蠅幼蟲(chóng)分泌物抗菌肽能顯著增強(qiáng)正常小鼠非特異性免疫功能，并有利于調(diào)節(jié)免疫平衡。
五、本發(fā)明抗菌肽對(duì)細(xì)菌感染小鼠的干預(yù)性研究本實(shí)驗(yàn)利用大腸埃希菌感染小鼠的疾病動(dòng)物模型，從家蠅幼蟲(chóng)分泌物抗菌肽干預(yù)后動(dòng)物的生理、生化及病理變化等幾個(gè)角度初步研究了抗菌肽的體內(nèi)作用，為抗菌肽在動(dòng)物體內(nèi)的作用提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
通過(guò)建立小鼠腹腔感染大腸埃希菌的動(dòng)物模型，按抗菌肽預(yù)防性干預(yù)組(感染前3天預(yù)防性給抗菌肽10mg/kg.d)、治療性干預(yù)組(感染后予抗菌肽10mg/kg)和對(duì)照組(予生理鹽水)給不同處理。首先，觀察感染后動(dòng)物的一般情況，檢測(cè)感染后不同時(shí)間段(4h、8h、12h、24h)腹腔液細(xì)菌計(jì)數(shù)；其次，檢測(cè)小鼠血清內(nèi)毒素、溶菌酶、一氧化氮(NO)含量，小鼠外周血TNF-α、IL-6等細(xì)胞因子水平；最后，比較了各組小鼠肝、肺、腎等重要臟器的病理形態(tài)學(xué)變化。
(一)抗菌肽對(duì)細(xì)菌感染小鼠血清TNF-α、IL-6、NO、內(nèi)毒素水平的影響1.抗菌肽對(duì)細(xì)菌感染小鼠細(xì)胞因子的影響細(xì)菌感染小鼠后，4h內(nèi)血清TNF-α的含量急劇上升，從正常小鼠的23.3pg/ml增加到158.56pg/ml，而給予家蠅幼蟲(chóng)抗菌肽后，TNF-α含量均有不同程度的下降，尤其以預(yù)防性給藥組較為明顯，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)，各時(shí)間段的TNF-α含量與模型組相比差異均有顯著性(P＜0.05)。
抗菌肽對(duì)小鼠血清TNF-α含量的影響

抗菌肽對(duì)小鼠血清IL-6含量的影響

2.抗菌肽對(duì)小鼠血清NO含量的影響抗菌肽對(duì)小鼠血清NO含量的影響

3.抗菌肽對(duì)小鼠血清內(nèi)毒素含量的影響抗菌肽對(duì)小鼠血清內(nèi)毒素含量的影響

(二)抗菌肽對(duì)小鼠腹腔液細(xì)菌數(shù)及器官組織結(jié)構(gòu)的影響
1.腹腔液細(xì)菌計(jì)數(shù)給細(xì)菌后4h，模型組小鼠腹腔液菌落計(jì)數(shù)可達(dá)4949CFU/μl，12h后降低為1594CFU/μl，而同期預(yù)防性和治療性給抗菌肽組小鼠的細(xì)菌數(shù)明顯少于模型組，其中以預(yù)防性給藥組效果尤為明顯，兩者與模型組相比較均P＜0.01，差異有極顯著性。
抗菌肽對(duì)細(xì)菌感染小鼠腹腔液細(xì)菌數(shù)的影響

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，感染細(xì)菌后，模型組小鼠腹腔液細(xì)菌量從4h的4949CFU/μl，降到12h的1594CFU/μl，說(shuō)明小鼠依靠自身的免疫力可以消滅一定的細(xì)菌，而抗菌肽組小鼠的細(xì)菌量明顯低于模型組，提示腹腔給予抗菌肽后，抗菌肽在小鼠體內(nèi)發(fā)揮了一定的抗細(xì)菌作用，可以殺滅細(xì)菌或抑制細(xì)菌繁殖，這個(gè)作用與機(jī)體的自身免疫力結(jié)合，最終增強(qiáng)了機(jī)體殺菌的功效。預(yù)防性給藥組小鼠的細(xì)菌量最少，可能是因?yàn)楦腥厩敖o予的抗菌肽在一定程度上提高了機(jī)體的抗感染能力所致。
2.各組小鼠肺組織學(xué)的變化大腸埃希菌感染8h后，小鼠肺泡隔增厚，有炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，可見(jiàn)肺組織淤血、出血及肺氣腫；感染后24h，小鼠肺組織損傷更加明顯，肺泡間隔明顯增厚，有大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，可見(jiàn)明顯的肺出血及肺氣腫。抗菌肽預(yù)防組，小鼠肺泡也有炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，肺泡隔有一定程度的增厚，但均較模型組明顯減輕，治療性給抗菌肽組炎癥程度介于抗菌肽預(yù)防組及模型組之間。
對(duì)器官組織結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察結(jié)果顯示，家蠅幼蟲(chóng)分泌物抗菌肽減輕了細(xì)菌內(nèi)毒素引起的肺、肝的組織損傷。
上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明對(duì)感染小鼠予抗菌肽干預(yù)后，能減少腹腔液的細(xì)菌數(shù)量，以預(yù)防性給藥后效果較好。同時(shí)抗菌肽能降低感染小鼠血清TNF-a、IL-6、NO、內(nèi)毒素含量；還可以在不同程度上降低感染對(duì)重要臟器的損害。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明采用透析、固相萃取、超濾和反相高效液相色譜方法分離純化家蠅幼蟲(chóng)分泌型抗菌肽，提供了一條簡(jiǎn)便、快捷、高效、蛋白質(zhì)得率高、抗菌活性穩(wěn)定及活性較好的抗菌肽提取路線，使抗菌肽制備時(shí)間縮短，提高了分離純化的效率。而且該抗菌肽具有提高特異性和非特異性免疫功能的作用，對(duì)細(xì)菌感染有一定的保護(hù)作用，為抗菌肽在制備藥物、保健品以及動(dòng)物飼料或防腐劑中的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明的實(shí)施例1取三齡家蠅幼蟲(chóng)置于干凈大燒杯中，充分清潔體表后浸于適量蒸餾水中4小時(shí)，不時(shí)振搖；吸取浸液離心10000g×10min，上清液冷凍干燥濃縮，即得抗菌肽粗提液，4℃保存?zhèn)溆?1)透析將濃縮的抗菌肽粗提液用截留分子量為3500道爾頓的透析袋透析過(guò)夜，其間換掉外液兩次；取內(nèi)液用0.22μm的無(wú)菌濾器過(guò)濾除菌，-20℃保存?zhèn)溆谩?2)固相萃取Sep-pak C18Cartridge固相萃取小柱用4ml甲醇活化后，4ml0.05％三氟乙酸平衡。取透析后抗菌肽粗提液1.5ml上柱，依次用5ml含0％～80％甲醇的0.05％三氟乙酸(TFA)溶液分步洗脫，流速為1ml/min；各洗脫組分冷凍干燥除掉甲醇(ACN)和三氟乙酸(TFA)后，超純水溶解，檢測(cè)該洗脫組分的抗菌活性；收集、濃縮、凍干具有活性的組分，超純水溶解，12000rpm離心10min，收集上清液-20℃保存?zhèn)溆谩?3)超濾將固相萃取活性組分合并后加到截留分子量為3KD的超濾管中，5000×g離心30min分離，透過(guò)超濾管的部分為分子量小于3KD的組分；繼續(xù)將未透過(guò)超濾管的組分加到截留分子量為30KD的超濾管中，同上離心，分別收集超濾管中和管下液體，將活性物質(zhì)分為三個(gè)部分分子量＞30KD、3～30KD、＜3KD，取各組分檢測(cè)蛋白濃度和抗菌活性。(4)反相高效液相色譜純化超濾后活性組分用0.22μm微孔濾膜過(guò)濾，100μl上C18反相色譜柱(Beckman，System Gold，U.S.A.，ODS 0.5μm，0.46×25cm)。流動(dòng)相A0.1％三氟乙酸(TFA)-水溶液；B0.1％三氟乙酸(TFA)-甲醇(ACN)溶液；色譜柱用5％甲醇(CAN)-0.1％三氟乙酸(TFA)溶液平衡，洗脫條件如下梯度洗脫，30min內(nèi)己腈濃度由5％上升至60％，流速1ml/min，手工收集214nm波長(zhǎng)洗脫峰，即獲得兩個(gè)抗菌肽組分。所得抗菌肽經(jīng)凍干之后為白色粉末狀固體。
本發(fā)明的實(shí)施例2將實(shí)施例1所得的抗菌肽1g和市獸的普通肉雞飼料1Kg混合，每天喂養(yǎng)肉雞2-3次，連續(xù)喂養(yǎng)30天，與添加中草藥抗生素喂養(yǎng)的肉雞相比，在出欄率、平均體重、飼料效率等方面差異均無(wú)顯著性，表明本發(fā)明抗菌肽有促進(jìn)生長(zhǎng)和提高免疫力的作用。
本發(fā)明的實(shí)施例3將實(shí)施例1所得的抗菌肽1g和市獸的肉豬飼料1Kg混合，每天喂養(yǎng)肉豬23次，連續(xù)喂養(yǎng)30天，與添加中草藥抗生素飼料喂養(yǎng)的肉豬相比，在出欄率、平均體重、飼料效率等方面差異均無(wú)顯著性。
本發(fā)明的實(shí)施例4將實(shí)施例1所得的抗菌肽用蒸餾水溶解后，加入食用表面活性劑溶液，完全溶解，用泵定量加入到高剪切攪拌的去離子水中，然后攪拌成熟，過(guò)濾，得到乳化液，該乳化液可作為防腐劑應(yīng)用于食品、藥品等的防腐。
本發(fā)明的實(shí)施例5本發(fā)明抗菌肽20％、羥基酯類(lèi)防腐劑1％、聚乙二醇400或丙二醇2.5％、氯化鈉0.6％、余量為水(所述百分比均為重量百分比)取羥基酯類(lèi)防腐劑溶解于適量水中，加熱至45℃左右使之全部溶解；再加入聚乙二醇400或丙二醇、氯化鈉，攪拌使全部溶解，高溫滅菌，制成輔料溶液；將實(shí)施例1所得的抗菌肽加入輔料溶液中，添加水至全量，混勻，分裝于定量噴霧器中，即得噴霧制劑。該制劑可用于治療外傷感染。
權(quán)利要求
1.一種家蠅分泌型抗菌肽的分離方法，其特征在于將抗菌肽粗提液進(jìn)行透析，透析內(nèi)液經(jīng)固相萃取，洗脫組分經(jīng)超濾分離，活性組分進(jìn)一步用反相高效液相色譜純化出兩個(gè)抗菌活性組分，即得家蠅分泌型抗菌肽。
2.按照權(quán)利要求1所述家蠅分泌型抗菌肽的分離方法，其特征在于所述的抗菌肽粗提液，即家蠅幼蟲(chóng)外分泌物粗提液的制備為取三齡家蠅幼蟲(chóng)置于干凈大燒杯中，充分清潔體表后浸于適量蒸餾水中4小時(shí)，不時(shí)振搖；吸取浸液離心10000g×10min，上清液冷凍干燥濃縮，即得抗菌肽粗提液，4℃保存?zhèn)溆谩?br> 3.按照權(quán)利要求1所述家蠅分泌型抗菌肽的分離方法，其特征在于(1)透析將濃縮的抗菌肽粗提液用截留分子量為3500道爾頓的透析袋透析過(guò)夜，其間換掉外液兩次；取內(nèi)液用0.22μm的無(wú)菌濾器過(guò)濾除菌，-20℃保存?zhèn)溆茫?2)固相萃取取透析后抗菌肽粗提液上Sep-pak C18 Cartridge固相萃取小柱，依次用5ml含0％～80％甲醇的0.05％三氟乙酸溶液分步洗脫，流速為1ml/min；各洗脫組分冷凍干燥除掉甲醇和三氟乙酸后，超純水溶解，檢測(cè)該洗脫組分的抗菌活性；收集、濃縮、凍干具有活性的組分，超純水溶解，12000rpm離心10min，收集上清液20℃保存?zhèn)溆茫?3)超濾將固相萃取活性組分合并后加到截留分子量為3KD的超濾管中，5000×g離心30min分離；繼續(xù)將未透過(guò)超濾管的組分加到截留分子量為30KD的超濾管中，同上離心，分別收集超濾管中和管下液體，將活性物質(zhì)分為三個(gè)部分分子量＞30KD、3～30KD、＜3KD，取各組分檢測(cè)蛋白濃度和抗菌活性；(4)反相高效液相色譜純化超濾后活性組分用0.22μm微孔濾膜過(guò)濾，100μl上C18反相色譜柱，流動(dòng)相A0.1％三氟乙酸-水溶液；B0.1％三氟乙酸-甲醇溶液；色譜柱用5％甲醇-0.1％三氟乙酸溶液平衡，洗脫條件為梯度洗脫，30min內(nèi)已腈濃度從5％上升到60％；流速1ml/min，手工收集214nm波長(zhǎng)洗脫峰，即獲得兩個(gè)抗菌肽組分。
4.按照權(quán)利要求3所述家蠅分泌型抗菌肽的分離方法，其特征在于所用的Sep-pak C18 Cartridge固相萃取小柱在加樣前預(yù)用4ml甲醇活化、4ml0.05％三氟乙酸-水平衡；所用的C18反相色譜柱為Beckman，System Gold，U.S.A.，ODS 0.5μm，0.46×25cm。
5.如權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述家蠅分泌型抗菌肽的分離方法分離得到的家蠅分泌型抗菌肽。
6.如權(quán)利要求5所述家蠅分泌型抗菌肽在制備提高特異性或非特異性免疫功能、抗細(xì)菌感染的藥物或保健品中的應(yīng)用。
7.如權(quán)利要求5所述家蠅分泌型抗菌肽在動(dòng)物飼料或防腐劑中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種家蠅分泌型抗菌肽的分離方法及其產(chǎn)品和應(yīng)用，將抗菌肽粗提液進(jìn)行透析，透析內(nèi)液經(jīng)固相萃取，洗脫組分經(jīng)超濾分離，活性組分進(jìn)一步用反相高效液相色譜純化出兩個(gè)抗菌活性組分，即得家蠅分泌型抗菌肽。本發(fā)明提供了一條簡(jiǎn)便、快捷、高效、蛋白質(zhì)得率高、抗菌活性穩(wěn)定及活性較好的抗菌肽提取路線，使抗菌肽制備時(shí)間縮短，提高了分離純化的效率。而且經(jīng)實(shí)驗(yàn)證明該抗菌肽具有提高特異性和非特異性免疫功能的作用，對(duì)細(xì)菌感染有一定的保護(hù)作用，為抗菌肽在制備藥物、保健品以及動(dòng)物飼料或防腐劑中的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。
文檔編號(hào)A61P31/00GK101054408SQ20071020037
公開(kāi)日2007年10月17日 申請(qǐng)日期2007年4月2日 優(yōu)先權(quán)日2007年4月2日
發(fā)明者吳建偉, 國(guó)果, 宋智魁, 付萍, 秦容貴, 張勇 申請(qǐng)人:貴陽(yáng)醫(yī)學(xué)院