專利名稱：一種絲素蛋白微載體及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種高分子微載體及其制備方法，特別涉及一種采用蠶絲絲素為主要 原料，并載有水溶性藥物的絲素蛋白微載體及其制備方法，屬生物醫(yī)學(xué)材料技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
高分子微球具有其它材料所不具備的特殊功能，是當(dāng)前的研究熱點(diǎn)之一。微球用 途廣泛，可用于藥物載體、酶和細(xì)胞的固定化、生物活性物質(zhì)的分離純化和細(xì)胞培養(yǎng)載體等 方面，其中將微球作為細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖載體(微載體)的研究逐漸受到人們的關(guān)注。微載體是 指直徑在60 250 μ m，用于貼壁依賴型細(xì)胞生長(zhǎng)的微珠，其巨大的比表面積可增大細(xì)胞 培養(yǎng)面積，實(shí)現(xiàn)大規(guī)模的細(xì)胞培養(yǎng)。此外，利用微載體進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，可用簡(jiǎn)單的顯微鏡觀 察細(xì)胞在微球表面的生長(zhǎng)情況，并簡(jiǎn)化了細(xì)胞生長(zhǎng)各種環(huán)境因素的檢測(cè)和檢控，同時(shí)可高 效利用培養(yǎng)基，并兼有單層培養(yǎng)和懸浮培養(yǎng)的優(yōu)勢(shì)，是一種先進(jìn)的細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)。早期微載體多采用合成聚合物制成，如聚羥乙基丙烯酸甲酯、葡聚糖、聚苯乙烯 等。合成聚合物制備的微載體重復(fù)性和力學(xué)性能較好，但缺乏細(xì)胞識(shí)別位點(diǎn)，影響細(xì)胞在其 表面的黏附、生長(zhǎng)。因此，生物相容性好、價(jià)格低廉的天然高聚物逐漸成為微載體原料的首 選。目前，常用的有膠原、明膠、纖維素、甲殼質(zhì)及其衍生物以及海藻酸鹽等。蠶絲絲素蛋白 作為一種天然高聚物，具有優(yōu)良的生物學(xué)性能及一定的生物可降解性，是較理想的制備微 載體的原料。生長(zhǎng)因子是一種可刺激細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖的細(xì)胞外多肽信號(hào)分子。將生長(zhǎng)因子裝載 到生物材料上可明顯促進(jìn)細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖，是生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一。然而生長(zhǎng) 因子半衰期短，極易失活，因此如何在制備微球過(guò)程中保持藥物活性仍然有待于進(jìn)一步探 討。載有生長(zhǎng)因子的芯-殼結(jié)構(gòu)絲素微載體具有其他材料所沒(méi)有的優(yōu)點(diǎn)，是一種具有發(fā)展 潛力的新型細(xì)胞微載體。在本發(fā)明作出之前，中國(guó)發(fā)明專利(CN 1556202A)公開(kāi)了一種動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)用 微載體及其制備方法，該發(fā)明利用脫脂棉銅氨溶液制備微球，以硫酸為致孔劑，用2-二 乙氨基氯乙烷鹽酸鹽修飾微球表面。這種多孔微載體具有非常大的比表面積，為細(xì)胞 提供了生長(zhǎng)空間。在中國(guó)發(fā)明專利(CN 1641017A) “一種用于大規(guī)模培養(yǎng)細(xì)胞的微載 體”中，采用明膠和殼聚糖溶液為原料制備實(shí)心與多孔微載體。該微載體可以支持細(xì)胞 生長(zhǎng)并能長(zhǎng)其月維持細(xì)胞功能。在“Gas foamed open porous biodegradable polymeric microspheres" [Biomaterials, 2006，27(2) : 152-159]文獻(xiàn)中，報(bào)道了以碳酸氫銨為致 孔劑，采用雙乳化法制備了 PLGA微載體，且OTH3T3細(xì)胞在其上黏附、分化效果良好。文獻(xiàn) "Employing human keratinocytes cultured on macroporous gelatin spheres to treat full thickness-wounds: an in vivo study on athymic rats" [Burns, 2007, 33 (6): 726-735]中公開(kāi)了一種制備直徑為133 321 μ m明膠微載體的技術(shù)方案，其角化細(xì)胞能 在載體表面及孔內(nèi)部較好的黏附與分化。大量研究表明，高分子微球在細(xì)胞培養(yǎng)領(lǐng)域具有 廣闊的發(fā)展前景，各種新材料制備的微球?qū)映霾桓F。
4
蠶絲蛋白是由蠶絹絲腺內(nèi)壁上的內(nèi)皮細(xì)胞分泌的高純度蛋白質(zhì)，由乙氨酸、丙氨酸、絲氨酸等二十多種氨基酸組成，具有良好的生物相容性和優(yōu)良的理化性能且可被生物 降解。在非紡織領(lǐng)域，家蠶絲素纖維已長(zhǎng)期用作外科手術(shù)縫合線。近年來(lái)，將絲素蛋白應(yīng)用 于人工皮膚、人工血管、人工骨、藥物緩釋載體以及酶固定材料的大量研究結(jié)果表明，絲素 蛋白材料無(wú)毒性、無(wú)刺激作用，對(duì)細(xì)胞的黏附、生長(zhǎng)、增殖以及分化的支持作用良好，其優(yōu)良 的理化性質(zhì)以及獨(dú)特的生物相容性，是一種應(yīng)用前景廣闊的生物材料。然而，將蠶絲絲素蛋 白制備成為細(xì)胞微載體的技術(shù)至今未見(jiàn)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種載藥率高，比表面積大，生物相容性好，適合于細(xì)胞培養(yǎng) 的絲素蛋白微載體及其制備方法。為實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是一種絲素蛋白微載體，它為 芯-殼結(jié)構(gòu)的微球狀，微球直徑為100 500 μ m;其殼層呈多孔結(jié)構(gòu)，孔徑為5 20 μ m, 殼層的成分為絲素蛋白，所述絲素蛋白的分子結(jié)構(gòu)中，無(wú)歸卷曲構(gòu)象為80% 90%，其余為 Silk I和Silk II構(gòu)象；其芯核的成分為水溶性藥物。本發(fā)明還提供上述絲素蛋白微載體的制備方法將蠶絲脫膠、溶解、透析處理后得 到濃度為1% 10%/wt的絲素蛋白溶液，其特征在于再進(jìn)行如下步驟的加工
1、將嗎啉-乙磺酸、N-羥基丁二酰亞胺和1-乙基_3 (3- 二甲基氨丙基)碳化二亞胺 溶解于絲素蛋白溶液中，得到殼層溶液；按質(zhì)量比，絲素蛋白嗎啉-乙磺酸N-羥基丁二 酰亞胺1-乙基_3 (3- 二甲基氨丙基)碳化二亞胺為1 :0. 05 0. 25 0. 05 0. 2 0. 1 0. 35。或者采用將京尼平溶解于絲素蛋白溶液中，按質(zhì)量比，絲素蛋白京尼平為1 0. 1 0. 40，得到殼層溶液。2、將水溶性藥物溶解后得到濃度為lOOng/ml lOOOng/ml的水溶性藥物芯層溶液。3、采用高壓靜電方法，將絲素殼層溶液和水溶性藥物芯層溶液經(jīng)兩個(gè)噴頭噴出微 米級(jí)的液滴，以液氮為凝固浴，得到具有芯_殼結(jié)構(gòu)的固化液滴；所述的兩個(gè)噴頭為同軸套 裝在一起，其中外層的一個(gè)為殼層溶液噴頭，內(nèi)層的一個(gè)為芯層溶液噴頭。4、采用冷凍干燥法將固化的液滴干燥，得到一種芯_殼結(jié)構(gòu)微球狀的絲素蛋白微 載體。本發(fā)明技術(shù)方案中所述的絲素蛋白為天然家蠶、柞蠶或天蠶絲素蛋白；所述的水 溶性藥物為酸性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子、轉(zhuǎn)化 生長(zhǎng)因子- β、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子- α、神經(jīng)生長(zhǎng)因子、胰島素樣生長(zhǎng)因子、血小板衍生因子等細(xì) 胞生長(zhǎng)因子中的一種或它們的任意組合。本發(fā)明技術(shù)方案中采用的高壓靜電工藝條件為電源電壓3 15 kV;芯核溶液的 推注速度為0. 1 1 ml/h，殼層溶液的推注速度為0. 1 5ml/h。本發(fā)明技術(shù)方案中，殼層溶液噴頭的噴針內(nèi)徑為1 2mm;芯層溶液噴頭的噴針外 徑為0. 45 1. 6mm,內(nèi)徑為0. 1 1. 2_。本發(fā)明的原理是將直流高壓電源施加于聚合物溶液或熔體與收集裝置之間，使聚合物溶液或熔體帶上幾千伏至上萬(wàn)伏高壓靜電，帶電液滴在電場(chǎng)力的作用下在注射器或 毛細(xì)管頂點(diǎn)被加速，當(dāng)電場(chǎng)力足夠大時(shí)，聚合物液滴可克服表面張力形成噴射細(xì)流。當(dāng)聚合 物溶液濃度較低，粘度較小時(shí)，其在一定范圍內(nèi)的高壓電場(chǎng)作用下會(huì)分化成連續(xù)的小液滴， 噴入凝固浴中即可得到粒徑均勻的微球。本發(fā)明采用的裝置具有兩個(gè)注射器，內(nèi)層針頭套在外層針頭內(nèi)并保持同軸，兩個(gè) 針頭之間留有一定的空隙，保證外層絲素溶液能夠順利流出與芯成分的生長(zhǎng)因子溶液匯 合。在高壓電場(chǎng)的作用下，兩液體在噴口處匯合時(shí)，由于時(shí)間極短，液滴固化前不會(huì)融合為 一體，從而形成具有芯-殼結(jié)構(gòu)的絲素蛋白微球。同時(shí)由于生長(zhǎng)因子溶液在電場(chǎng)作用下噴 出后全部包埋于微球內(nèi)部，基本無(wú)損失，因此這種芯_殼結(jié)構(gòu)的絲素微球具有較高的藥物 包埋率。將EDC加入絲素溶液中后，其首先與蛋白質(zhì)羧基側(cè)鏈偶合形成一種中間產(chǎn)物酰基 異脲，然后受到蛋白質(zhì)上伯胺基團(tuán)的親核試劑進(jìn)攻而形成酰胺交聯(lián)，從而使蛋白質(zhì)水溶液 迅速形成凝膠。參與反應(yīng)的基團(tuán)有天冬氨酸、谷氨酸、賴氨酸等。當(dāng)加入NHS及MES可以 提高交聯(lián)效果。而當(dāng)京尼平加入到絲素溶液中時(shí)，絲素分子上的自由氨基可對(duì)京尼平上的 3-C原子發(fā)起親核攻擊，使六元環(huán)發(fā)生開(kāi)環(huán)形成新的醛基，新生成的二級(jí)胺可與醛基形成新 的分子內(nèi)共價(jià)鍵。同時(shí)京尼平自身在一定條件下可以發(fā)生聚合反應(yīng)，再與絲素分子上的自 由氨基發(fā)生反應(yīng)形成分子間的共價(jià)鍵，達(dá)到交聯(lián)效果。絲素微球中的孔是其中的冰升華后留下的空隙。在絲素溶液冷凍過(guò)程中，當(dāng)絲素 溶液中的水的溫度低于冰點(diǎn)而過(guò)冷卻時(shí)，由于熱交換而產(chǎn)生了微小的冰核，只要過(guò)冷卻的 程度足以使不穩(wěn)定相(絲素溶液相)中水的化學(xué)勢(shì)比冰核高，冰核便可以成為較大的冰粒 子。而周圍的絲素溶液則相應(yīng)的被濃縮，使處于無(wú)歸卷曲結(jié)構(gòu)的絲素分子間距離縮短，不同 線團(tuán)上的鏈段相互貫穿，形成了連續(xù)的絲素溶液相。其后將分散在絲素相中的冰升華后，便 得到了多孔絲素材料。經(jīng)冷凍干燥制備的絲素微球表面及內(nèi)部均呈多孔結(jié)構(gòu)，孔之間的連 通性較好，非常適合用于細(xì)胞載體或藥物緩釋系統(tǒng)。本發(fā)明具有以下明顯優(yōu)點(diǎn)
1、由于絲素蛋白材料無(wú)毒性、無(wú)刺激作用，因此，本發(fā)明提供的微載體對(duì)細(xì)胞的黏附、 生長(zhǎng)、增殖以及分化的支持具有良好的作用，特別適用于作為細(xì)胞培養(yǎng)的微載體；同時(shí)，該 微球表面及內(nèi)部呈多孔結(jié)構(gòu)，增大了比表面積，為細(xì)胞提供了生長(zhǎng)空間；還由于生長(zhǎng)因子 被包埋在絲素微球的內(nèi)部，可較好的保持其活性，并可靠微孔通道實(shí)現(xiàn)藥物的持續(xù)、緩慢釋 放。本發(fā)明技術(shù)方案提供的絲素蛋白微球除了可用做細(xì)胞培養(yǎng)載體外，還可用做藥物緩釋 載體、酶固定材料等。2、利用同軸高壓靜電技術(shù)和冷凍干燥法，可以得到粒徑可控、具有芯-殼結(jié)構(gòu)的 多孔再生絲素微球。該法工藝過(guò)程簡(jiǎn)單、設(shè)備簡(jiǎn)易、微球載藥率和包埋率較高、粒徑分布均 勻并且尺寸可控，方便選擇最適合細(xì)胞生長(zhǎng)的微球大小，是一種制備絲素微球的新方法。3、采用再生絲素水溶液制備絲素微球，整個(gè)工藝過(guò)程無(wú)需添加引發(fā)劑、表面活性 劑、有毒試劑或有機(jī)溶劑等，不會(huì)引起絲素蛋白生物相容性的降低。


圖1是本發(fā)明實(shí)施例提供的絲素微球殼層的紅外吸收光譜圖。
6
圖2和圖3分別是本發(fā)明實(shí)施例提供的絲素微載體的電子顯微鏡照片。圖4是本發(fā)明實(shí)施例提供的絲素微載體橫截面的電子顯微鏡照片。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例和附圖對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步描述 實(shí)施例一
將150 g家蠶生絲放入6 L質(zhì)量濃度為0. 05%的Na2CO3水溶液中，于98 100°C處理 30min,重復(fù)3次，使蠶絲脫膠，充分洗滌干燥后得到純絲素纖維。將純絲素纖維加入三元溶 液中(由CaCl2/水/乙醇摩爾比為1:8:2配成)溶液中，在72°C攪拌溶解成絲素蛋白混合 溶液。將所得到的絲素混合溶液裝入透析袋中，用去離子水透析4天，以除去雜質(zhì)(Li、Br 等)，得到純的絲素蛋白溶液。調(diào)節(jié)絲素蛋白溶液的質(zhì)量濃度為3%，將絲素質(zhì)量20%的EDC、10%的NHS、20%的MES 均勻加入絲素溶液中，得到絲素殼層溶液。將血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子配置為濃度為800ng/ml的水溶性藥物芯層溶液。將絲素殼層溶液與水溶性藥物芯層溶液分別加入到殼層和芯層的注射器內(nèi)，采用 高壓靜電方法，將絲素殼層溶液和水溶性藥物芯層溶液經(jīng)兩個(gè)噴頭噴出微米級(jí)的液滴，以 液氮為凝固浴，得到具有芯_殼結(jié)構(gòu)的固化液滴。采用高壓靜電的具體方法是高壓靜電 發(fā)生器的正極與兩個(gè)噴頭連接，所述的兩個(gè)噴頭為同軸套裝在一起，其中外層的一個(gè)為殼 層溶液噴頭，內(nèi)層的一個(gè)為芯層溶液噴頭；高壓靜電發(fā)生器的負(fù)極與收集裝置連接，收集裝 置用鋪有鋁箔的塑料盒做成。接通電源后，在電場(chǎng)力的牽伸作用下，芯、殼層溶液經(jīng)兩個(gè)同 軸的噴頭噴出微米級(jí)的液滴，用液氮作為凝固浴使液滴凝固，得到具有芯-殼結(jié)構(gòu)的固化 液滴。液滴直徑可通過(guò)調(diào)整絲素溶液濃度、高壓靜電發(fā)生器的工作電壓、噴頭噴針的直徑 及芯、殼溶液的推注速度等方法控制。在本實(shí)施例中，高壓靜電發(fā)生器的工作固定電壓為 9 kV，極距10 cm,殼層溶液噴頭的內(nèi)徑為1. 6mm,芯層溶液噴頭噴針的外徑為1mm，內(nèi)徑為 0. 7mm，芯層溶液的推注速度為0. 1 ml/h，殼層溶液的推注速度為lml/h。將上述固化液滴進(jìn)行冷凍干燥，冷凍干燥的工藝條件為在-60°C的溫度條件下 以2°C /min的升溫速度升至室溫，再干燥處理12h，得到難溶于水的芯-殼結(jié)構(gòu)的絲素微 球。參見(jiàn)附圖1，它是本實(shí)施例提供的絲素微球殼層的紅外吸收光譜圖，由圖1可以看 到，其分子構(gòu)象以無(wú)歸卷曲為主，約占90%，同時(shí)還含有少量的silk I和silk II結(jié)構(gòu)。參見(jiàn)附圖2和3，它們分別是本實(shí)施例提供的絲素微載體的電子顯微鏡照片，由圖 2可以看到，所提供的絲素微載體為微球狀，微球平均直徑為452. 8 μ m ；由圖3可以清楚地 看到，絲素微載體的殼層呈多孔結(jié)構(gòu)，孔徑為5 20 μπι。參見(jiàn)附圖4，它是本實(shí)施例提供的絲素微載體橫截面的電子顯微鏡照片，由圖4可 以看到，其芯核與殼層的結(jié)構(gòu)不同，殼層為絲素蛋白，呈多孔結(jié)構(gòu)，芯核的成分為水溶性藥 物，結(jié)構(gòu)致密。實(shí)施例二
將100 g柞蠶生絲放入5 L質(zhì)量濃度為0. 25%的Na2CO3水溶液中，于98 100°C處理 45 min，重復(fù)3次，使蠶絲脫膠，充分洗滌干燥后得到柞蠶絲素纖維。將柞蠶絲素纖維加入熔融的四水合硝酸鈣中，在105°C攪拌溶解成柞蠶絲素蛋白混合溶液。將所得到的混合溶 液裝入透析袋中，用去離子水透析4天，去除雜質(zhì)得到純的柞蠶絲素蛋白溶液。調(diào)節(jié)柞蠶絲素溶液的質(zhì)量濃度為1. 5%，將絲素質(zhì)量20%的EDC、10%的NHS、20%的 MES均勻加入絲素溶液中，得到絲素殼層溶液。將胰島素樣生長(zhǎng)因子配置為濃度為500ng/ ml的水溶性藥物芯層溶液。將殼層和芯層兩種溶液分別倒入注射器內(nèi)，固定 電壓6 kV，極距10 cm，芯層溶液 的推注速度0. 2ml/h，殼層溶液的推注速度為2ml/h，外噴針的內(nèi)徑為2mm，內(nèi)噴針的外徑為 1. 2mm,內(nèi)徑為0. 9mm，用液氮作為凝固浴使液滴凝固。將上述固化液滴進(jìn)行冷凍干燥，冷凍干燥的工藝條件為在-20°C的溫度條件下 以速度為0. 2V /min升溫至室溫，再干燥處理72h，得到難溶于水的絲素微球。經(jīng)檢測(cè)，微球表面及內(nèi)部呈多孔結(jié)構(gòu)，平均直徑為523. 6 μ m，不溶于水。實(shí)施例三
用煮沸的濃度為3. 5%。的Na2CO3溶液處理天蠶繭共三次，每次30 min,使蠶絲脫膠，充 分洗滌干燥后得到天蠶絲素纖維。將天蠶絲素纖維加入熔融的四水合硝酸鈣中，在90°C攪 拌溶解成天蠶絲素蛋白混合溶液。將所得到的混合溶液裝入透析袋中，用去離子水透析4 天，去除雜質(zhì)得到純的天蠶絲素蛋白溶液。 調(diào)節(jié)天蠶絲素溶液濃度為2%，將絲素質(zhì)量20%的EDC、10%的NHS、20%的MES均勻 加入絲素溶液中，得到殼層溶液。將神經(jīng)生長(zhǎng)因子配置為濃度為200ng/ml的水溶性藥物芯層溶液。將殼層和芯層兩種溶液分別倒入注射器內(nèi)，固定電壓10 kV，極距10 cm,芯層溶液 的推注速度0. 15 ml/h，殼層溶液的推注速度為3ml/h，外噴針的內(nèi)徑為1mm，內(nèi)噴針的外徑 為0. 45mm,內(nèi)徑為0. 2mm，用液氮作為凝固浴使液滴凝固。將上述固化液滴進(jìn)行冷凍干燥，冷凍干燥的工藝條件為在_30°C的溫度條件下 以速度為l°c /min升溫至室溫，再干燥處理40 h，得到難溶于水的絲素微球。經(jīng)檢測(cè)，該微球表面及內(nèi)部呈多孔結(jié)構(gòu)，平均直徑為128. 3 μ m，不溶于水。實(shí)施例四
將150 g家蠶生絲放入6 L質(zhì)量濃度為0. 05%的Na2CO3水溶液中，于98 100°C處理 30 min，重復(fù)3次，使蠶絲脫膠，充分洗滌干燥后得到純絲素纖維。將純絲素纖維加入9. 3 mol/1的LiBr水溶液中，在65士2°C攪拌溶解成絲素蛋白混合溶液。將所得到的絲素混合 溶液裝入透析袋中，用去離子水透析4天，以除去LiBr等雜質(zhì)，得到純的絲素蛋白溶液。調(diào)節(jié)絲素溶液的質(zhì)量濃度為6%，將絲素質(zhì)量10%的京尼平均勻加入絲素溶液中， 37°C反應(yīng)12 h，得到殼層溶液。將堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子配置為濃度為600ng/ml的水 溶性藥物芯層溶液。將殼層和芯層兩種溶液分別倒入注射器內(nèi)，固定電壓llkV，極距10 cm，芯層溶液 的推注速度0.5 ml/h，殼層溶液的推注速度為1.5ml/h，外噴針的內(nèi)徑為1.2mm，內(nèi)噴針的 外徑為0. 9mm,內(nèi)徑為0. 6mm，用液氮作為凝固浴使液滴凝固。將上述固化液滴進(jìn)行冷凍干燥，冷凍干燥的工藝條件為在_50°C的溫度條件下 以速度為1. 5°C /min升溫至室溫，再干燥處理20h，得到難溶于水的絲素微球。經(jīng)檢測(cè)，微球表面及內(nèi)部呈多孔結(jié)構(gòu)，平均直徑為363. 6 μ m，不溶于水。
實(shí)施例五
將150 g家蠶生絲放入6 L質(zhì)量濃度為0. 05%的Na2CO3水溶液中，于98 100°C處理 30 min，重復(fù)3次，使蠶絲脫膠，充分洗滌干燥后得到純絲素纖維。將純絲素纖維加入9. 3 mol/1的LiBr水溶液中，在65士2°C攪拌溶解成絲素蛋白混合溶液。將所得到的絲素混合 溶液裝入透析袋中，用去離子水透析4天，以除去LiBr等雜質(zhì)，得到純的絲素蛋白溶液。調(diào)節(jié)絲素溶液濃度為5%，將絲素質(zhì)量20%的京尼平均勻加入絲素溶液中，37°C反 應(yīng)12 h，得到殼層溶液。將轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β配置為濃度為300ng/ml的水溶性藥物芯層溶 液。將殼層和芯層兩種溶液分別倒入注射器內(nèi)，固定電壓12 kV，極距10 cm,芯層溶液 的推注速度0. 7ml/h，殼層溶液的推注速度為2ml/h，外噴針的內(nèi)徑為1mm，內(nèi)噴針的外徑為 0. 8mm,內(nèi)徑為0. 5mm，用液氮作為凝固浴使液滴凝固。對(duì)固化液滴采用冷凍干燥處理，工藝 條件可以為在溫度為_(kāi)60°C _20°C的條件下，以速度為0. 2V 2V /min升溫至室溫，再 在室溫條件下干燥處理12h 72h，得到難溶于水的絲素微球。經(jīng)檢測(cè)，微球表面及內(nèi)部呈 多孔結(jié)構(gòu)，平均直徑為216.4 μ m，不溶于水。
9
權(quán)利要求
一種絲素蛋白微載體，其特征在于它為芯 殼結(jié)構(gòu)的微球狀，微球直徑為100～500 μm；其殼層呈多孔結(jié)構(gòu)，孔徑為5～20 μm，殼層的成分為絲素蛋白，所述絲素蛋白的分子結(jié)構(gòu)中，無(wú)歸卷曲構(gòu)象為80%～90%，其余為 SilkⅠ和SilkⅡ構(gòu)象；其芯核的成分為水溶性藥物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種絲素蛋白微載體，其特征在于絲素蛋白為天然家蠶、 柞蠶或天蠶的絲素蛋白。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種絲素蛋白微載體，其特征在于所述水溶性藥物為下述 細(xì)胞生長(zhǎng)因子中的一種或它們的任意組合酸性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、堿性成纖維細(xì)胞生 長(zhǎng)因子、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-α、神經(jīng)生長(zhǎng)因子、胰島素 樣生長(zhǎng)因子、血小板衍生因子。
4.一種制備如權(quán)利要求1所述的絲素蛋白微載體的方法，將蠶絲脫膠、溶解、透析處 理后得到濃度為1% 10%/wt的絲素蛋白溶液，其特征在于再進(jìn)行如下步驟的加工(1)將嗎啉-乙磺酸、N-羥基丁二酰亞胺和1-乙基-3(3-二甲基氨丙基)碳化二亞胺 溶解于絲素蛋白溶液中，得到殼層溶液；按質(zhì)量比，絲素蛋白嗎啉-乙磺酸N-羥基丁二 酰亞胺1-乙基_3 (3- 二甲基氨丙基)碳化二亞胺為1 :0. 05 0. 25 0. 05 0. 2 0. 1 0. 35 ；(2)將水溶性藥物溶解，制備濃度為lOOng/ml lOOOng/ml的芯層溶液；(3)采用高壓靜電方法，將殼層溶液和芯層溶液經(jīng)兩個(gè)噴頭噴出微米級(jí)的液滴，以液氮 為凝固浴，得到具有芯-殼結(jié)構(gòu)的固化液滴；所述的兩個(gè)噴頭為同軸套裝在一起，其中外層 的一個(gè)為殼層溶液噴頭，內(nèi)層的一個(gè)為芯層溶液噴頭；(4)采用冷凍干燥法將固化的液滴干燥，得到一種芯_殼結(jié)構(gòu)微球狀的絲素蛋白微載體。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種制備絲素蛋白微載體的方法，其特征在于高壓靜電方 法的工藝條件為電源電壓3 15 kV ；芯核溶液的推注速度為0. 1 1 ml/h，殼層溶液的 推注速度為0. 1 5ml/h。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種制備絲素蛋白微載體的方法，其特征在于殼層溶液噴 頭的噴針內(nèi)徑為1 2mm ；芯層溶液噴頭的噴針外徑為0. 45 1. 6mm,內(nèi)徑為0. 1 1. 2mm。
7.一種制備如權(quán)利要求1所述的絲素蛋白微載體的方法，將蠶絲脫膠、溶解、透析處 理后得到濃度為1% 10%/wt的絲素蛋白溶液，其特征在于再進(jìn)行如下步驟的加工(1)將京尼平溶解于絲素蛋白溶液中，按質(zhì)量比，絲素蛋白京尼平為1:0. 1 0. 40，得 到殼層溶液；(2)將水溶性藥物溶解，制備濃度為lOOng/ml lOOOng/ml的芯層溶液；(3)采用高壓靜電方法，將殼層溶液和芯層溶液經(jīng)兩個(gè)噴頭噴出微米級(jí)的液滴，以液氮 為凝固浴，得到具有芯-殼結(jié)構(gòu)的固化液滴；所述的兩個(gè)噴頭為同軸套裝在一起，其中外層 的一個(gè)為殼層溶液噴頭，內(nèi)層的一個(gè)為芯層溶液噴頭；(4)采用冷凍干燥法將固化的液滴干燥，得到一種芯-殼結(jié)構(gòu)微球狀的絲素蛋白微載體。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的一種制備絲素蛋白微載體的方法，其特征在于高壓靜電方 法的工藝條件為電源電壓3 15 kV ；芯核溶液的推注速度為0. 1 1 ml/h，殼層溶液的推注速度為ο. 1 5ml/h。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的一種制備絲素蛋白微載體的方法，其特征在于殼層溶液噴 頭的噴針內(nèi)徑為1 2mm ；芯層溶液噴頭的噴針外徑為0. 45 1. 6mm,內(nèi)徑為0. 1 1. 2讓。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種高分子微載體及其制備方法，屬于生物醫(yī)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明采用同軸高壓靜電技術(shù)和冷凍干燥法，將絲素溶液與藥物溶液在高壓電場(chǎng)的作用下分化成具有芯-殼結(jié)構(gòu)的微米級(jí)液滴，經(jīng)液氮凝固后，再經(jīng)冷凍干燥制得難溶于水的微載體。該微載體為芯-殼結(jié)構(gòu)的微球狀，微球直徑為100～500μm；其殼層成分為絲素蛋白，所述絲素蛋白分子，其中無(wú)歸卷曲構(gòu)象為80%～90%；殼層呈多孔結(jié)構(gòu)，孔徑為5～20μm；其芯核成分為水溶性藥物。這種絲素微載體在細(xì)胞培養(yǎng)、藥物緩釋等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)A61P43/00GK101972481SQ20101054018
公開(kāi)日2011年2月16日 申請(qǐng)日期2010年11月11日 優(yōu)先權(quán)日2010年11月11日
發(fā)明者盧神州, 呂強(qiáng), 李明忠, 王璐 申請(qǐng)人:蘇州大學(xué)