專利名稱：黃芪皂苷Ⅱ在制備抗肝癌藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及中藥有效成分提取及應(yīng)用技術(shù)領(lǐng)域。具體涉及黃芪皂苷II在制備抗肝癌藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
正常機(jī)體中細(xì)胞凋亡和細(xì)胞增殖總是在嚴(yán)密調(diào)控下維持動態(tài)平衡，該平衡一旦被打破，將導(dǎo)致許多疾病的發(fā)生，由于細(xì)胞凋亡功能下降，突變細(xì)胞不能被有效地清除，不斷堆積形成腫瘤。能誘導(dǎo)凋亡的藥物在腫瘤治療中發(fā)揮重要的作用。多藥耐藥(Mtltidrug Resistance，MDR)是腫瘤細(xì)胞由一種藥物誘發(fā)后，同時對多種結(jié)構(gòu)和功能不同的化療藥物產(chǎn)生交叉耐藥的相象。腫瘤MDR的機(jī)制異常復(fù)雜，是多基因、 多步驟綜合作用的結(jié)果。除了主要與多藥耐藥基因(mtltidrug resistance gene, mdrl) 及其編碼產(chǎn)物P-糖蛋白(P-glyco-protein，P-gp)所介導(dǎo)的經(jīng)典機(jī)制外，還與凋亡相關(guān)基因(如Bcl-2，RaS，P53)等介導(dǎo)的非經(jīng)典機(jī)制密切相關(guān)。多藥耐藥性目前已經(jīng)成為臨床腫瘤化療失敗的主要原因，如何解決這一問題是目前抗腫瘤研究的熱點(diǎn)，其中尋找多藥耐藥性逆轉(zhuǎn)劑或化療增敏劑(chemosensitizer，⑶)是解決MDR問題的有效手段之一。黃芪是常用的補(bǔ)益類中藥，具有補(bǔ)氣升陽，益衛(wèi)固表等功效，臨床常用劑型有黃芪注射液，黃芪粗制劑或以黃芪為主的復(fù)方。李偉等報道黃芪注射液具有抗心肌缺血及心肌保護(hù)作用(黃芪皂苷注射液對心得安誘發(fā)心衰犬心臟舒縮功能的影響，中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2009年12期81-83頁)，另外還有報道稱其對腎臟、肺有保護(hù)作用及抗貧血作用。近年來發(fā)現(xiàn)黃芪注射液和參附注射液聯(lián)合使用有減少化療藥物毒副作用的發(fā)生、提高機(jī)體免疫功能、提高患者的生存質(zhì)量的作用(參附注射液聯(lián)合黃芪注射液對惡性腫瘤化療毒副作用的影響，山東醫(yī)藥，2009年第8期，89-90頁)，劉成軍等報道了黃芪注射液對人鼻咽癌CNE2 荷瘤裸鼠移植瘤具有抑制作用，其機(jī)制可能與誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、降低腫瘤組織中P53和 Bcl-2蛋白的表達(dá)有關(guān)(黃芪注射液對人鼻咽癌CNE2荷瘤裸鼠移植瘤具有抑制作用，中草藥，2010年第6期，968-970頁)。另外，還有謝少茹等報道了黃芪多糖對胃癌細(xì)胞的抑制作用及其機(jī)制(河北中醫(yī)，2009年第9期，第137-144頁)。我們在前期研究中發(fā)現(xiàn)黃芪總苷對小鼠肝癌(HepA)與肉瘤(S180)具有抑瘤作用，并且體外抑制肝癌Hela細(xì)胞的生長。以上報道多數(shù)采用聯(lián)合治療的方式，即使單獨(dú)使用黃芪注射液、黃芪多糖或黃芪總皂苷進(jìn)行研究，也因?yàn)槠涑煞謴?fù)雜(黃芪注射液含有多糖類、皂苷類、黃酮類和氨基酸類等成分)、量效關(guān)系不明確等原因，均未能指出是何種具體成分發(fā)揮了上述治療作用。關(guān)于其中單體化合物的作用，尤其是關(guān)于黃芪皂苷類單體的抗腫瘤作用研究仍未見任何報道。 關(guān)于黃芪皂苷II，亦沒有報道公布其具有上述作用，也未見將其制成抗腫瘤制劑的報道。另外，黃芪總皂苷或者黃芪注射液也由于成分復(fù)雜，導(dǎo)致難以對其質(zhì)量和穩(wěn)定性進(jìn)行控制，使其滿足現(xiàn)代用藥要求。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于克服現(xiàn)有技術(shù)不足，提供結(jié)構(gòu)組分確證、量效關(guān)系確切的抗腫瘤藥物，尤其是用于提供逆轉(zhuǎn)多藥耐藥而發(fā)揮抗腫瘤作用的藥物。為此，本發(fā)明提供如下技術(shù)解決方案。黃芪皂苷II在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。黃芪皂苷(Astragaloside，AS) II的結(jié)
構(gòu)如下所述腫瘤為肝癌。肝癌是我國高發(fā)的惡性腫瘤，據(jù)統(tǒng)計，每年約有13萬人死于肝癌，占全世界肝癌年死亡人數(shù)的43. %?；熢陬A(yù)防術(shù)后腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著不可替代的作用，但由于多藥耐藥的存在，使得化療效果降低或無效，嚴(yán)重影響了病人的預(yù)后和生
活質(zhì)量。所述黃芪皂苷II通過逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞的多藥耐藥性發(fā)揮抗腫瘤作用。所述黃芪皂苷II與其他藥物同時給藥或序貫給藥發(fā)揮抗腫瘤作用。本發(fā)明的有益效果1.本發(fā)明提供了量效關(guān)系明確、結(jié)構(gòu)組分確證的抗腫瘤藥物，為臨床抗腫瘤新藥的開發(fā)奠定了基礎(chǔ)；2.本發(fā)明提供了逆轉(zhuǎn)多藥耐藥發(fā)揮抗腫瘤作用的藥物，為解決化療藥物多藥耐藥現(xiàn)象提供了新方案。


圖1黃芪皂苷薄層色譜圖(I VI為分離組分)圖2黃芪皂苷HPLC圖(Α.混標(biāo)溶液；B.組分III ；C.組分I ； 1.黃芪皂苷IV ；2.黃芪皂苷II )圖3流式細(xì)胞儀檢測AS II，AS IV對BEL-7402和BEL-7402/5-FU細(xì)胞凋亡的影響圖4流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率的變化(#Ρ < 0. OlVS BEL-7402, η = 3)圖5三種化療藥物對BEL-7402和BEL-7402/5-FU細(xì)胞的殺傷效應(yīng)圖6 AS II、AS IV對 BEL-7402 和 BEL-7402/5-FU 細(xì)胞的劑量-效應(yīng)曲線lanel :BEL_7402 細(xì)胞lane2 :BEL_7402/FU 細(xì)胞lane3 :BCL-7402/FU+5_FU(0. 025mg/mL)lane4 :BCL-7402/FU+5_FU+ASII(0. 08mg/mL)
lane5 :BCL-7402/FU+5_FU+ASII(0. 16mg/mL)lane6 :BCL-7402/FU+5_FU+ASIV(0. 08mg/mL)lane7 :BCL-7402/FU+5_FU+ASIV(0. 16mg/mL)lane8 :BCL-7402/FU+5_FU+VRP(0. OOlmg/mL))圖 7 mdrl 基因的表達(dá)(**p < 0. Ol vs BEL-7402/5-FU，η = 3)圖8半定量PCR產(chǎn)物的定量分析A. BEL-7402 組B. BEL-7402/FU 組C. BEL-7402/FU+0. 08mg/mL AS II 組D. BEL-7402/FU+0. 16mg/mL AS II 組E. BEL-7402/FU+0. 08mg/mL AS IV組F. BEL-7402/FU+0. 16mg/mL AS IV組G. BEL-7402/FU+0. OOlmg/mLVRP 組圖9 P-gp蛋白的免疫組化染色結(jié)果(與BEL-7402/5-FU組比較，#為P < 0. Ol η = 5)圖10 P-gp蛋白表達(dá)的定量分析圖11流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞內(nèi)Rhol23表達(dá)率(*p < 0. 05，< 0. 01 vs BEL-7402/5-FU, η = 3)圖12 Rho 123熒光表達(dá)率分析lanel :BEL_7402 細(xì)胞lane2 :BEL_7402/FU 細(xì)胞lane3 :BCL-7402/FU+5_fu(0. 025mg/mL)lane4 :BCL_7402/FU+5-fu+ASII(0. 08mg/mL)lane5 :BCL_7402/FU+5-fu+ASII(0. 16mg/mL)lane6 :BCL_7402/FU+5-fu+ASIV(0. 08mg/mL)lane7 :BCL_7402/FU+5-fu+ASIV(0. 16mg/mL)lane8 :BCL_7402/FU+5-fu+VRP(0. OOlmg/mL)圖 13 Bcl-2、Bax 基因表達(dá)(**p < 0. 01 vs BEL-7402/5-FU，η = 3)圖14半定量PCR產(chǎn)物的定量分析
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1黃芪皂苷II和IV的制備1.實(shí)驗(yàn)材料1. 1試藥黃芪(原產(chǎn)地甘肅，購自國投藥業(yè)安徽有限公司，批號080623 ；經(jīng)安徽中醫(yī)學(xué)院藥用植物學(xué)教研室劉守金教授鑒定為膜莢黃芪)；黃芪皂苷IV標(biāo)準(zhǔn)品(中國藥品生物制品檢定所，批號0781-200210)；黃芪皂苷II標(biāo)準(zhǔn)品(上海中藥標(biāo)準(zhǔn)化研究中心提供，批號07-1015)；硅膠高效G板(青島海洋化工廠)；柱層析用硅膠(青島海洋化工集團(tuán))；DlOl樹脂(天津友昌工貿(mào)有限公司)；乙醇、正丁醇、乙酸乙酯、甲醇為分析純，乙腈為色譜純，水為重蒸餾水。
1.2 儀器Agilent IlOOSeriesAgilent ChemStationCTG-10 提取器TU-1800SPC紫外可見分光光度計AB135-S電子分析天平RE-52旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器ZK-82B真空干燥箱UV-8三用紫外儀2.實(shí)驗(yàn)方法2. 1黃芪總皂苷的提取與分離稱取黃芪藥材^g，置于CTG-10提取器中，用70%乙醇回流提取2次，第1次加10 倍量，第2次加8倍量，每次lh。合并提取液，減壓回收乙醇，濃縮至10升。水飽和的正丁醇(1 1)萃取三次，合并正丁醇部分，回收正丁醇萃取液濃縮至約1L。2. 2黃芪總皂苷的富集與純化稱取DlOl大孔樹脂適量，按規(guī)定程序處理后裝柱，然后用95%的乙醇反復(fù)洗脫， 至洗脫液與水(1 幻混合不產(chǎn)生混濁，再用蒸餾水反復(fù)洗脫，至無乙醇味，并且樹脂柱不再下降時即可。濃縮后的萃取液緩慢加到DlOl樹脂柱(7. 5cmX95cm，樹脂高度64cm)上， 先以四倍柱體積的蒸餾水洗脫，以除去糖類成分，繼以四倍柱體積的70%乙醇洗脫，收集 70%醇洗脫液，置旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上濃縮，水浴蒸干后稱重。2.3黃芪皂苷的分離與提取稱取300g硅膠裝柱(4. 2cmX 100cm，硅膠高度78cm)，將2. 2制備的黃芪總皂苷， 加少量甲醇溶解后裝柱，分別以不同比例的乙酸乙酯甲醇(100 25,100 30)洗脫，每 50mL收集一流份，經(jīng)薄層色譜檢測，合并相同部分，濃縮蒸干，稱重，依次得組分I 組分VI 部分。2. 4薄層色譜法鑒別黃芪皂苷2.4. 1對照品溶液的制備精密稱取黃芪苷II和IV標(biāo)準(zhǔn)品各l.Omg，用ImL甲醇溶解，搖勻，即得黃芪皂苷II 和IV濃度均為Img · mr1的對照品溶液。2. 4. 2供試品溶液的制備精密稱取黃芪總皂苷IOmg ；組分I 組分VI 5mg,分別用ImL甲醇溶解，作為供試品溶液。2. 4. 3 TLC 法硅膠高效G板用0. 3mol -L^1NaH2PO4溶液浸泡，115°C活化汕備用。取供試品溶液和對照品溶液各10 μ L，點(diǎn)于薄層板上，以氯仿一甲醇一乙酸乙酯一水(6 3 1 1)放置過夜的下層溶液為展開劑，展距15cm，展開，取出，吹干，噴以10%硫酸乙醇溶液，置烘箱中105°C加熱至斑點(diǎn)顯色清晰，同時置紫外光燈(365nm)下檢視。2. 5黃芪總皂苷含量測定2. 5. 1對照品溶液的制備
高效液相色譜儀配備示差檢測器色譜工作站
湖南省衡陽市藥物機(jī)械廠北京普析通用儀器有限責(zé)任公司 Mettler Toledo 上海青浦滬西儀器廠上海市實(shí)驗(yàn)儀器總廠無錫科達(dá)儀器廠
精密稱取黃芪苷IV標(biāo)準(zhǔn)品5. Omg，置于IOmL的容量瓶中，用無水乙醇溶解并稀釋至刻度，搖勻即得。2. 5. 2標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備精密吸取對照品溶液0. 05，0. 1,0. 2,0. 3,0. 4和0. 5mL，置具塞試管中，加無水乙醇補(bǔ)足體積至0. 5mL，再分別加入8%的香草醛無水乙醇試液0. 5mL和72%的硫酸5. OmL搖勻，立即放入62 °C恒溫水浴中，保溫20min后，置冷水浴中冷卻至室溫，于540nm波長處測吸光度。同時以隨行試劑作空白。以吸光度⑴為縱坐標(biāo)，黃芪苷IV的濃度Pg^mr1(X)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算回歸方程。2. 5. 3供試品溶液的制備精密稱取黃芪總皂苷約10mg，置25mL容量瓶中，加無水乙醇溶解并稀釋至刻度， 作為供試品溶液。精密吸取供試品溶液0. 2mL，照標(biāo)準(zhǔn)曲線項(xiàng)下方法處理并測定吸光度。2.6高效液相色譜法2. 6. 1色譜條件色譜柱ZorboxXDB-C8 (4. 6 X 1. 50mm，5 μ m)；流動相乙腈水=34 66 ；柱溫:25°C ；示差檢測器光學(xué)單元溫度:32°C ；流速1. Oml · mirT1。2.6. 2對照品溶液的制備取TLC項(xiàng)下的對照品溶液適量，分別加甲醇稀釋成濃度為0. 5,0. 25，0. 125,0. 063 和0.03 ^*!!^1對照品溶液。按上述色譜條件，分別進(jìn)樣10 μ L。以峰面積為縱坐標(biāo)，對照品溶液的質(zhì)量數(shù)(yg)為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸。2. 6. 3供試品溶液的制備與測定精密稱取組分I 組分VI各lmg，加ImL甲醇溶解，取20 μ L，注入液相色譜儀，按上述色譜條件測定，記錄峰面積，由回歸方程計算各組分中黃芪皂苷II和IV的含量。2. 6. 4精密度試驗(yàn)取濃度為0. 125mg · mL—1的對照品溶液，重復(fù)進(jìn)樣5次，每次10 μ L，記錄峰面積并計算RSD值。2. 6. 5重復(fù)性試驗(yàn)取供試品組分I 5份，分別制備各供試品溶液，照上述色譜條件進(jìn)行測定，記錄峰面積并計算RSD值。2.6.6回收率試驗(yàn)精密稱取5份組分I，組分III樣品1. Omg,分別制備各供試品溶液。其中組分I樣品溶液中加入濃度為0. 125mg ^mr1的黃芪皂苷II對照品溶液0. 5mL，組分III樣品溶液中加入濃度為0. 125mg .mL-1的黃芪皂苷IV對照品溶液0. 5mL,依法操作，測定，計算加樣回收率。3.結(jié)果3. 1黃芪總皂苷的富集與純化DlOl大孔樹脂的70%醇洗脫液回收乙醇，蒸干后稱重得總黃芪皂苷6. 5g。3. 2黃芪皂苷硅膠柱層析的分離結(jié)果見表1表1硅膠柱層析分離的黃芪皂苷組分
權(quán)利要求
1.黃芪皂苷II在制備抗肝癌藥物中的應(yīng)用。
2.如權(quán)利要求1的應(yīng)用，所述黃芪皂苷II通過逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞的多藥耐藥性發(fā)揮協(xié)助抗肝癌作用。
3.如權(quán)利要求1的應(yīng)用，所述黃芪皂苷II與其他藥物同時給藥或序貫給藥發(fā)揮抗肝癌作用。
全文摘要
本發(fā)明涉及中藥有效成分提取及應(yīng)用技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明提供的黃芩皂苷Ⅱ在不同濃度時對兩種人肝癌細(xì)胞株BEL-7402和BEL-7402/5-FU細(xì)胞的增殖具有明顯抑制作用，可與其他藥物同時給藥或序貫給藥發(fā)揮抗腫瘤作用。本發(fā)明提供了量效關(guān)系明確、結(jié)構(gòu)組分確證的抗腫瘤藥物，為臨床抗腫瘤新藥的開發(fā)奠定了基礎(chǔ)；提供了逆轉(zhuǎn)多藥耐藥發(fā)揮抗腫瘤作用的藥物，為解決化療藥物多藥耐藥現(xiàn)象提供了新方案。
文檔編號A61P35/00GK102160867SQ20101054790
公開日2011年8月24日 申請日期2010年11月17日 優(yōu)先權(quán)日2010年11月17日
發(fā)明者王培培, 許杜娟, 高建 申請人:安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院