專利名稱：防止蛋白質(zhì)c降解的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及酶學(xué)，特別是涉及防止被活化的蛋白質(zhì)C降解的方法。
蛋白質(zhì)C是絲氨酸蛋白酶和天然存在的抗凝劑，它在調(diào)節(jié)止血中通過激活凝血級聯(lián)中的因子Ⅴa和Ⅷa而發(fā)揮作用。人類蛋白質(zhì)C是作為有461個氨基酸的單一多肽在體內(nèi)主要在肝臟中產(chǎn)生的。該前體分子受到多重轉(zhuǎn)譯后修飾，包括1)裂解42氨基酸信號序列;2)從一鏈酶原上蛋白水解除去155位上的賴氨酸殘基和156位上的精氨酸殘基以得到二鏈形式的分子(即155個氨基酸殘基的輕鏈通過二硫橋鍵連接到含絲氨酸蛋白酶的262個氨基酸殘基的重鏈上);3)群集在輕鏈前42個氨基酸殘基中的9個谷氨酸殘基經(jīng)維生素K依賴性羧化作用，產(chǎn)生9個γ-羧基谷氨酸殘基;4)在4個位點(diǎn)上連接糖(1個在輕鏈中，3個在重鏈中)。重鏈含有已明確證實(shí)的有Asp257、His 211和Ser360三位組合的絲氨酸蛋白酶。最后，在鈣離子存在下，在體內(nèi)于磷脂表面由凝血酶激活循環(huán)的2鏈酶原。由于除去重鏈N末端的十二肽而導(dǎo)致的活化作用，產(chǎn)生具有酶促活性的被激活的蛋白質(zhì)C(aPC)。
在用大量和高濃度aPC進(jìn)行的工作中，觀察到在重鏈308位賴氨酸處的蛋白水解剪切部分。該剪切所產(chǎn)生的N末端序列以Glu-Ala-Lys開始，并從重鏈的C末端產(chǎn)生稱為“EAK片段”的111氨基酸片段。EAK片段沒有通過二硫鍵共價(jià)連接到輕鏈上或重鏈上的N末端部分上。EAK片段還含有絲氨酸蛋白酶的活性位點(diǎn)絲氨酸，但沒有Asp或His殘基。因此，發(fā)現(xiàn)帶有EAK片段的蛋白質(zhì)C制劑已改變了抗凝血劑活性。本發(fā)明包括通過在變性劑中，或在極端鹽濃度中于降低的pH下保存分子以防止或減少蛋白質(zhì)C分子降解的方法。
為描述本發(fā)明的目的，對本文中使用的術(shù)語定義如下。
aPC-活化的人蛋白質(zhì)C。
APTT-活化的部分組織促凝血酶原激酶時間。
AU-酰胺水解單位。
BME-β-巰基乙醇。
CHES-2[N-環(huán)己基氨基]乙烷磺酸。
EAK片段-在蛋白質(zhì)C重鏈的308位剪切而產(chǎn)生的111氨基酸片段。
EDTA-乙二胺四乙酸。
HEPES-N-2-羥乙基哌嗪-N′-2-乙烷磺酸。
HPC-人蛋白質(zhì)C酶原。
MEA-2-氨基乙醇。
MES-2-(N-嗎啉代)-乙烷磺酸。
新生蛋白質(zhì)-在mRNA轉(zhuǎn)錄本轉(zhuǎn)譯后產(chǎn)生的，進(jìn)行任何轉(zhuǎn)譯后修飾之前的多肽。但例如谷氨酸殘基的β羧化和天冬氨酸殘基的羥化等轉(zhuǎn)譯后修飾作用可能在從mRNA轉(zhuǎn)錄本完全轉(zhuǎn)譯成蛋白質(zhì)之前開始出現(xiàn)。
蛋白質(zhì)C活性-負(fù)責(zé)蛋白質(zhì)水解、酰胺水解、酯水解和生物學(xué)(抗凝血或血纖維蛋白溶解)活性的人蛋白質(zhì)C的任何性質(zhì)。試驗(yàn)蛋白質(zhì)C抗凝血和酰胺水解活性的方法是本領(lǐng)域中已知的(參見Grinnellet al.，1987，Bio/Technology51189-1192)。
rHPC-重組產(chǎn)生的人蛋白質(zhì)C酶原。
酶原-蛋白水解酶的酶學(xué)無活性前體。本文所說的蛋白質(zhì)C酶原是指一鏈或二鏈的，分泌的、無活性形式的蛋白質(zhì)C。
本說明書中所用的所有氨基酸縮寫都是如37 C.F.R.§1.822(b)(2)(1990)中所列的被美國專利與商標(biāo)局接受的氨基酸縮寫詞。
本發(fā)明涉及防止或最大限度減少活化的蛋白質(zhì)C自發(fā)降解的方法。本發(fā)明是通過在低pH下，例如，在大約pH6.3至pH7.0條件下完成活化的蛋白質(zhì)C的加工、純化和/或儲存而給出最佳實(shí)例的。也可在3M尿素中保溫aPC(在除去變性劑后得以完全回收aPC活性)，或在極端鹽濃度的存在下保溫aPC來盡可能地減少aPC的自發(fā)降解。為本公開的目的，極端鹽濃度是指鹽濃度在大約0.4摩爾以上或大約0.05摩爾以下。本發(fā)明也包括使aPC保持在低pH，在變性劑中，或在極端鹽濃度下的aPC配制品。
蛋白質(zhì)C在維持止血中的作用，已激發(fā)了對使用該化合物作為多種血管病的治療劑的很大興趣。在工業(yè)規(guī)模上生產(chǎn)高水平和高濃度的人蛋白質(zhì)C已暴露出這樣一個事實(shí)，即該分子可發(fā)生自發(fā)降解而導(dǎo)致抗凝血活性的降低。aPC的自發(fā)降解導(dǎo)致從重鏈的C末端形成一個稱為“EAK片段”的111氨基酸片段。EAK片段沒有通過二硫鍵共價(jià)連接到輕鏈上或重鏈的N末端部分上。EAK片段還包括絲氨酸蛋白酶的活性位點(diǎn)絲氨酸殘基，但沒有Asp或His殘基。因此，由于存在蛋白水解修剪，帶有EAK片段的蛋白質(zhì)C制劑已改變了抗凝血活性。
為了最大限度地減少或防止導(dǎo)致形成EAK片段的自發(fā)降解，可將完整的被活化的蛋白質(zhì)C分子保存在大約6.3至7.0之間的pH條件下。在整個純化和活化過程中，以及在最終的配制溶液中，均可使分子保持在這一范圍的pH條件下。可使用許多不同的緩沖液體系來維持溶液的pH。有代表性的緩沖液體系包括Tris-乙酸鹽、檸檬酸鈉、檸檬酸鹽-甘氨酸和磷酸鈉。熟練的技術(shù)人員將會理解到，可以利用其他許多也可用于本發(fā)明方法中的緩沖液體系。
本發(fā)明的另一方面涉及將活化的蛋白質(zhì)C分子保存在具有極端鹽濃度的溶液中，以防止或減少EAK片段的形成。例如，在pH7.0的磷酸鈉緩沖液中，當(dāng)緩沖液中沒有鹽時EAK片段生成最少。但在pH7.0的磷酸鈉緩沖液中，當(dāng)緩沖液內(nèi)存在濃度約0.4M的氯化鈉時EAK片段生成也最少。在這兩個鹽濃度之間，EAK片段以可變的速度形成;但熟練的技術(shù)人員將會理解到，鹽濃度保持在0.05M以下或0.4M以上時，將最容易防止或減少EAK片段的形成。雖然當(dāng)溶液的pH保持在大約pH7.0，且不向溶液中加鹽時可得到最好的醫(yī)藥配制品，但使用低于0.05M的其他鹽濃度(如0.01M或0.005M)也是可取的。熟練的技術(shù)人員可以理解到，在藥物加工和配制中可以使用許多不同的鹽?？捎糜诒景l(fā)明的有代表性的鹽包括氯化鉀、氯化鈉，以及最優(yōu)選的氯化鈉。
本發(fā)明的再一個方面涉及通過在變性劑存在下進(jìn)行純化和/或配制來防止或盡可能減少活化的蛋白質(zhì)C自發(fā)降解?？墒褂迷S多不同的變性劑，但最優(yōu)選的變性劑是濃度為大約3M的尿素。
本發(fā)明不只限于生產(chǎn)被活化的蛋白質(zhì)C的方法。雖然最有效的是使用重組DNA技術(shù)生產(chǎn)活化的蛋白質(zhì)C，但最近大規(guī)模純化技術(shù)的進(jìn)展已允許從人血清中分離顯著量的活化的蛋白質(zhì)C。得到如此大量的蛋白質(zhì)C，即可一次加工高濃度的活化的蛋白質(zhì)C。如上所述，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)活化的蛋白質(zhì)C的濃度在每毫升約50毫克以上時，證明有伴隨抗凝血劑活性降低的活化的蛋白質(zhì)C分子的自動降解，最重要的是，自動降解的速率隨著溶液中活化的蛋白質(zhì)C的濃度增加而增加。然而在工業(yè)水平上，不能以很低的蛋白質(zhì)濃度有效地進(jìn)行大規(guī)模純化處理。
從活化的蛋白質(zhì)C生產(chǎn)的工業(yè)和醫(yī)藥實(shí)用性角度看，必須在遠(yuǎn)超過50毫克的濃度下加工該分子，本發(fā)明即可使熟練的技術(shù)人員在沒有明顯丟失產(chǎn)品活性的情況下大量生產(chǎn)該產(chǎn)品。另外，本發(fā)明的配方允許以比現(xiàn)有技術(shù)已知配制品更長的時間穩(wěn)定地儲存活化的蛋白質(zhì)C溶液。
熟練的技術(shù)人員將會理解到，本發(fā)明的方法將會使實(shí)踐本發(fā)明的人能夠以比以前可達(dá)到的濃度更高的濃度制得更大體積的活化的蛋白質(zhì)C，而不必害怕因自動降解造成產(chǎn)品丟失。另外，可以按照Toylor，Jr.等人的美國專利5，009，889號中所述方法很容易地使用本發(fā)明的穩(wěn)定的藥物配制品治療患有身體病癥的病人。
下列實(shí)施例是為舉例說明本發(fā)明而提供的，它們并不構(gòu)成對本發(fā)明的限制。
實(shí)施例1人蛋白質(zhì)C的生產(chǎn)可按照本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，例如美國專利4，981，952號(Yan)中所述的技術(shù)(該文獻(xiàn)全文列為本文參考文獻(xiàn))，在人腎293細(xì)胞中生產(chǎn)重組人蛋白質(zhì)C(rHPC)。Bang等人在美國專利4，775，624號(其全文列為本文參考文獻(xiàn))中公開要求保護(hù)了編碼人蛋白質(zhì)C的基因。用于在293細(xì)胞中表達(dá)人蛋白質(zhì)C的質(zhì)粒是Bang等人在美國專利4，992，373中公開的質(zhì)粒pLPC。歐洲專利申請0445939號中，以及Grinnell等人在Bio/Technology 5∶1189-1192(其內(nèi)容也列為本文參考文獻(xiàn))中也描述了質(zhì)粒pLPC的構(gòu)建。簡單地說，將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到293細(xì)胞中，然后鑒定穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化體，再培養(yǎng)并使之生長在無血清培養(yǎng)基中。發(fā)酵后，經(jīng)微過濾得到無細(xì)胞培養(yǎng)基。
按照美國專利4，981，952號中公開的Yan的技術(shù)從培養(yǎng)液中分離出人蛋白質(zhì)C。澄清的培養(yǎng)基配制到濃度達(dá)4mM的EDTA中后，使其吸附到陰離子交換樹脂(Fast-Flow Q，Pharmacia)上。用4倍柱體積的20mM Tris、200mM NaCl(pH7.4)和2倍柱體積的20mM Tris、150mM NaCl(pH7.4)洗柱后，用20mM Tris、150mM NaCl、10mM CaCl2(pH7.4)洗脫結(jié)合的重組人蛋白質(zhì)C酶原。洗脫后用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法判斷，洗脫的蛋白質(zhì)純度大于95%。
為進(jìn)一步純化該蛋白質(zhì)，將蛋白質(zhì)溶在濃度達(dá)3M的NaCl中后，吸附到在20mM Tris、3M NaCl、10mM CaCl2，pH7.4中平衡的疏水相互作用樹脂(Toyopearl Phenyl 650M，TosoHaas)上。用2倍柱體積沒有CaCl2的平衡緩沖液洗柱后，用20mM Tris，pH7.4洗脫重組人蛋白質(zhì)C。制備洗脫的蛋白質(zhì)，以通過除去殘留的鈣而使之活化。使重組人蛋白質(zhì)C通過金屬親和柱(Chelex-100，Bio-Rad)以除去鈣并再次結(jié)合到陰離子交換劑(Fast-Flow Q，Pharmacia)上。這兩個柱串聯(lián)排列并在20mM Tris、150mM NaCl、5mM EDTA，pH7.4中平衡。蛋白質(zhì)上柱后，用1倍柱體積的同一緩沖液洗Chelex-100柱，然后從串聯(lián)系列上將其斷開。用3倍柱體積的平衡緩沖液洗陰離子交換柱后，用0.4M NaCl、20mM Tris-乙酸鹽，pH6.5洗脫蛋白質(zhì)。通過在UV 280nm的消光值上測定重組人蛋白質(zhì)C和重組活化的蛋白C溶液的蛋白質(zhì)濃度(E0.1%分別為1.85或1.95)。
實(shí)施例2重組人蛋白質(zhì)C的激活在50mM HEPES、pH7.5存在下，于4℃將牛凝血酶偶聯(lián)到活化的CH-Sepharose 4B(Pharmacia)上。偶聯(lián)反應(yīng)在已裝入柱中的樹脂上進(jìn)行，每毫升樹脂約使用5000單位凝血酶。凝血酶溶液通過柱約循環(huán)3小時后，加入MEA達(dá)到每升循環(huán)溶液0.6ml的濃度。使含有MEA的溶液繼續(xù)循環(huán)10-12小時，以確保完全封閉樹脂上未反應(yīng)的胺。封閉后，用10倍柱體積的1MNaCl、20mM Tris、pH6.5洗偶聯(lián)了凝血酶的樹脂，以除去所有非特異性結(jié)合的蛋白質(zhì)，并在激活緩沖液中平衡后用于活化反應(yīng)。
將純化的rHPC加于EDTA中使?jié)舛冗_(dá)5mM(以螯合任何殘留的鈣)，并用20mM Tris、pH7.4或20mMTris-乙酸鹽、pH6.5將蛋白質(zhì)稀釋到2mg/ml的濃度，使該材料通過37℃用50mM NaCl和20mM Tris(pH7.4)或20mM Tris-乙酸鹽(pH6.5)平衡的凝血酶柱。調(diào)整流速以使rHPC與凝血酶樹脂之間的接觸時間約為20分鐘。收集流出液并立即進(jìn)行酰胺水解活性分析。如果該材料沒有與已確定的aPC標(biāo)準(zhǔn)品差不多的比活性(酰胺水解活性)，則使之再次通過凝血酶柱循環(huán)，以完全激活rHPC。然后用20mM上述pH為7.4或6.5的緩沖液以1∶1比例稀釋該材料以使aPC保持在低濃度，同時等待進(jìn)行下一加工步驟。
將aPC結(jié)合到已在含150mM NaCl的活化緩沖液(20mM Tris，pH7.4或20mMTris-乙酸鹽，pH6.5)中平衡的陰離子交換樹脂(Fast-FlowQ，Pharmacia)上，以從aPC材料中除去濾出的凝血酶。在這些條件下凝血酶不與陰離子交換樹脂作用，但可通過柱進(jìn)入流出液中。一旦aPC上柱后，即用2-6倍柱體積的20mM平衡緩沖液洗柱，然后用加在5mM Tris-乙酸鹽，pH6.5或20mM Tris，pH7.4中的0.4MNaCl洗脫結(jié)合的aPC。用較大體積緩沖液洗柱有利于更充分地除掉十二肽。將從該柱洗脫的材料以冷凍溶液(-20℃)形式或作為凍干粉末儲存。
使用Beckman DU-7400二極管陣列分光光度計(jì)檢測從合成底物H-D-Phe-Pip-Arg-對位硝基酰苯胺(S-2238)(購自Kabi Vitrum)釋放的對位硝基苯胺，以確定aPC的酰胺水解活性(AU)。1單位激活的蛋白質(zhì)C定義為使用9620M-1cm-1的對位硝基苯胺在405nm處的消光系數(shù)，在1分鐘內(nèi)釋放1μmol對位硝基苯胺(25℃，pH7.4)所需酶的量。
在激活的部分組織促凝血酶原激酶時間(APTT)凝血試驗(yàn)中，檢測凝血時間的延長以確定被激活的蛋白質(zhì)C的抗凝血活性。在稀釋緩沖液(1mg/ml放射免疫試驗(yàn)級BSA、20mM Tris，pH7.4，150mM NaCl，0.02% NaN3)中制備蛋白質(zhì)C濃度范圍為125-1000ng/ml的標(biāo)準(zhǔn)曲線，同時在該濃度范圍內(nèi)以幾個稀釋度制備樣品。向各樣品容器內(nèi)加入50μl冷馬血清和50μl重新配制的激活的部分組織促凝血酶原激酶時間試劑(APTT Reagent，Sigma)，并于37℃保溫5分鐘。保溫后，向各小瓶內(nèi)加入50μl適當(dāng)?shù)臉?biāo)準(zhǔn)樣品。用稀釋緩沖液代替樣品或標(biāo)準(zhǔn)品以確定基礎(chǔ)凝血時間。在向各樣品或標(biāo)準(zhǔn)品中加入50μl的30mM CaCl2(37℃)后，立即開始纖凝計(jì)(fibrometer)(CoA Screener Hemostasis Analyzer，American Labor)的計(jì)時。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性回歸方程計(jì)算樣品中的激活的蛋白質(zhì)C濃度。這里所報(bào)告的凝血時間是包括標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品在內(nèi)的這次重復(fù)之最小值的平均數(shù)。
為了制備用于比較研究的樣品，于25℃保溫44小時后或者于4℃在陰離子交換樹脂(FFQ，Pharmacia)(pH7.4)上濃縮后，使aPC(7.3mg/ml，在20mMTris、150mM NaCl中)完全自動降解。對樣品進(jìn)行酰胺水解活性分析、HPLC分析、N末端序列測定和SDS-PAGE分析，以進(jìn)一步證實(shí)和確定自動降解的量，以及氨基酸序列上的裂解位點(diǎn)。
實(shí)施例3激活的蛋白質(zhì)C穩(wěn)定性試驗(yàn)監(jiān)測AU以檢查pH對aPC活性的影響。以使用各50mM MES(pH5.5-7)、HEPES(pH6.8-8.2)和CHES(pH8.6-10)的三個緩沖系統(tǒng)確立范圍為6-9.3的pH條件(以0.3pH單位逐漸增加)。用適當(dāng)?shù)膒H緩沖液將aPC稀釋到0.4mg/ml的終濃度，并在此濃度保溫，然后檢測活性。使用在保溫pH下進(jìn)行的酰胺水解試驗(yàn)，于保溫開始時和4℃保溫30小時后分析各樣品。這些檢測結(jié)果顯示出酰胺水解活性對pH的鐘形pH依賴性曲線。結(jié)果示于下列表Ⅰ中。
表1酰胺水解速率(IU/mgaPC)pH0小時30小時6.01.631.586.64.004.637.29.166.687.811.269.268.47.055.169.03.533.53
pH7.4時顯示aPC有最大活性，而在6和9.3的極端pH時則顯示出大大降低的活性。雖然在極端pH時aPC似乎保留某些酰胺水解活性，但這一數(shù)據(jù)揭示可通過避免使aPC有最大活性的pH條件來減少自發(fā)降解。
為了確定是否aPC的酰胺水解活性對pH的依賴性是EAK片段形成的函數(shù)，于pH6.0、7.5和9.0條件下，將1.5mg/ml的aPC樣品于4℃保溫18小時。對EAKHPLC峰下面積進(jìn)行積分，并定量觀察SDS-PAGE上的EAK帶來檢測所形成的EAK的量。這些數(shù)據(jù)顯示，在pH6.0條件下保溫過程中EAK產(chǎn)生量沒有增加，而在pH7.5時約增加30%，且在pH9.0時增加50%，盡管在pH7.5和9.0樣品中有提高的EAK片段水平，但當(dāng)在pH7.4條件下檢測時，該制劑仍有高的AU活性。因此，EAK片段的產(chǎn)生為一定與酰胺水解活性相關(guān)。確切地說，EAK片段必須一直保持與aPC重鏈之其余部分的足夠聯(lián)系，以維持絲氨酸蛋白酶功能性。如果有所區(qū)別的話，較高EAK片段含量是與較高酰胺水解活性相關(guān)聯(lián)的。
EAK片段含有催化三元組(包括見于重鏈N末端部分中的His 211和Asp 257)的活性位點(diǎn)絲氨酸(殘基360)。因此，如果EAK片段沒有共價(jià)連接到重鏈的其余部分上，則該蛋白水解剪切就可能導(dǎo)致酶促活性降低。為了探討不同量的EAK對抗凝血活性的影響，按照實(shí)施例1和2中所述方法制備不同的幾批aPC。用濃度范圍為22-198μM的底物(＃S-2238)，濃度范圍為1.6-3.3nM(75-150ng/ml，在20mM Tris，pH7.4，150mM NaCl中)的aPC進(jìn)行酰胺水解試驗(yàn)。結(jié)果示于下列表Ⅱ中。
表Ⅱ百分EAK含量與比活性(酰胺水解和抗凝活性)的關(guān)系比活性樣品序號%EAKAU/mgAPTT/mg131.132.112191.351.73351.521.374511.641.005671.680.78利用降解的pH依賴性產(chǎn)生含不同量EAK的aPC樣品，按上文實(shí)施例1和2中所述方法制備這些樣品，將有不同含量EAK片段的樣品與完整的aPC(＜3%EAK片段)相比較。以三個不同的酶濃度檢測各批樣品的酰胺水解動力學(xué)參數(shù)，包括Km、Kcat和Vmax值。結(jié)果總結(jié)于表Ⅲ中。
表Ⅲ動力學(xué)數(shù)據(jù)樣品序號[aPC]KmVmaxKcat(% EAK)ng/ml(mM)(umol/ml/分)(1/秒)1(20%)1500.129102711130.1286346.61750.1987136.72(67%)1500.18106728.221130.1897297.52750.1899307.63(100%)1500.161314210.131130.1423371.83750.183160.2在實(shí)驗(yàn)變量內(nèi)，三個aPC樣品的Km值看來是相同的，并且顯示0.16mM底物平均值。這一結(jié)果提示，在被降解的aPC中對S-2238底物的親和性沒有被破壞。令人驚奇的是，降解的材料仍然具有基本上與完整aPC相似的AU活性。
既使有高EAK片段含量，被活性的蛋白質(zhì)C亦可能對三肽底物(＃S-2238)有完整的酰胺水解功能?？稍贏PTT試驗(yàn)中檢測體外抗凝活性。
意想不到的是，高AU活性與抗凝活性無相互關(guān)聯(lián)。雖然AU活性隨著EAK含量的增加而增加，但APTT活性卻隨著EAK含量增加而降低。
在不同的pH水平和鹽濃度下保溫被活化的蛋白質(zhì)C的樣品，然后每小時檢測EAK片段形成的百分?jǐn)?shù)，以研究鹽濃度對EAK片段形成和被活化的蛋白質(zhì)C穩(wěn)定性的影響。檢測中所用蛋白質(zhì)C濃度為每毫升4-5毫克。所有檢測實(shí)驗(yàn)均在5-20mM磷酸鹽緩沖液中進(jìn)行。使用的鹽(當(dāng)存在鹽時)是氯化鈉，并且所有檢測都在25℃下完成。用HPLC積分法測定每小時形成的EAK片段的百分量。結(jié)果示于下列表Ⅳ中。
表Ⅳ鹽濃度對EAK片段形成的影響pH鹽濃度形成的EAK百分量/小時6.4400nM0.0947.0400mM0.1456.450mM0.2927.050mM0.3656.400.0387.000.09權(quán)利要求
1.最大限度減少活化的蛋白質(zhì)C降解的方法，該方法包括將所說的活化的蛋白質(zhì)C保存在pH約為6.3至7.0溶液中。
2.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中所說的溶液具有低于約0.050M或高于約0.40M的鹽濃度。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中所說的溶液具有低于約0.050M的鹽濃度。
4.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中所說的溶液具有低于約0.010M的鹽濃度。
5.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中溶液中的鹽是氯化鈉。
6.最大限度減少活化的蛋白質(zhì)C降解的方法，該方法包括將所說的活化的蛋白質(zhì)C保存在含有變性劑的溶液中。
7.穩(wěn)定的藥物配制品，其包含加在pH約為6.3至7.0的溶液中的活化的蛋白質(zhì)。
8.根據(jù)權(quán)利要求7的藥物配制品，其進(jìn)一步包含濃度低于約0.050M或高于約0.4M的鹽。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的藥物配制品，其中鹽濃度低于約0.05M。
10.根據(jù)權(quán)利要求7的藥物配制品，其中緩沖液選自Tris-乙酸鹽、檸檬酸鈉、檸檬酸鹽-甘氨酸和磷酸鈉。
全文摘要
本發(fā)明涉及阻止或最大限度減少被活化的蛋白質(zhì)C自發(fā)降解的方法。作為最佳實(shí)例，本發(fā)明是在低pH下，例如pH約6.3至6.5條件下加工、純化和/或儲存被活化的蛋白質(zhì)C而完成的。也可以在3M尿素中保溫aPC(除去變性劑后完全回收aPC活性)，或在極端鹽濃度存在下保溫aPC而最大限度地減少aPC的自發(fā)降解。本發(fā)明還包括將aPC保存在低pH條件下的、變性劑中的或極端鹽濃度下的aPC配制品。
文檔編號A61K47/02GK1109891SQ95101130
公開日1995年10月11日 申請日期1995年1月4日 優(yōu)先權(quán)日1994年1月5日
發(fā)明者小·W·F·普勞蒂, J·塞克尼克 申請人:伊萊利利公司