專(zhuān)利名稱：一種促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素，其制劑及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素，還涉及其制劑和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素是從新鮮乳豬肝臟中提取的小分子量多肽類(lèi)混合物，分子量在 10，000左右。其藥理作用主要為可刺激正常肝細(xì)胞DNA的合成，促進(jìn)肝細(xì)胞再生，對(duì)損傷的肝細(xì)胞有保護(hù)作用，促進(jìn)肝功能的恢復(fù)，還有調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫功能和抗肝纖維化作用。臨床上用于治療重型肝炎、慢性活動(dòng)性肝炎和肝硬化等。目前，針對(duì)促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素這一生物制劑類(lèi)藥物，已經(jīng)有很多專(zhuān)利和文獻(xiàn)報(bào)道。在專(zhuān)利ZL03116052. 2中，公開(kāi)了一種促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素注射液及制備方法，其中的肝細(xì)胞生長(zhǎng)素為從乳豬中提取分離獲得的一種活性蛋白質(zhì)，該專(zhuān)利稱該肝細(xì)胞生長(zhǎng)素中的蛋白質(zhì)有15種氨基酸組成，占總蛋白含量的60%以上，分子量為2. 1萬(wàn)道爾頓。專(zhuān)利ZL200610047371. 0公開(kāi)了一種促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素水針劑制劑的制備方法，其中公開(kāi)了一種促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素溶液的制備方法，包括以下步驟1)選材；幻組織處理；3) 勻漿低溫勻漿2分鐘；4)凍融反復(fù)凍融3次；5)熱變性去除大分子蛋白升溫至85°C，恒溫5分鐘；6)離心；7)分級(jí)超濾及病毒滅活一級(jí)超濾收集分子量30，OOODa以下的組分； 二級(jí)超濾收集分子量為10，OOODa以下的多肽組分，60°C保溫10小時(shí)，滅活病毒。但上述專(zhuān)利中并未對(duì)肝細(xì)胞生長(zhǎng)素的成分進(jìn)行進(jìn)一步深入的研究和分析，發(fā)明人在專(zhuān)利ZL93120999. 4中已經(jīng)公開(kāi)了一種促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素的組成成分，但經(jīng)過(guò)發(fā)明人的深入研究，得到了一種新的、含量更高、活性更強(qiáng)的促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的首要發(fā)明目的在于提供了一種促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素；本發(fā)明的第二發(fā)明目的在于提供了這種促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素的制劑；本發(fā)明的第三發(fā)明目的在于提供了這種促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素的用途。為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的發(fā)明目的，采用的技術(shù)方案為一種促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素，所述的促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素溶液采用高效液相色譜法分析，在分析條件為流動(dòng)相甲醇水的體積比為10 90，色譜柱hypersil ODS 4. 6X300mm(5um)，波長(zhǎng)256nm，流速0. 8ml/min，具有12個(gè)色譜組分峰，其保留時(shí)間和峰面
積為峰號(hào)保留時(shí)間min峰面積％12.131、-2.17241.47- 44.9922.436、-2.6230.917- 2.6532.582、-2.8231.02 '2.5643.099、-3.3531.02 '5.8253.349、-3.8514.10 9.9663.845、-4.1094.77 '10.5174.066、-4.2583.13-'3.6784.206、-5.3313.04 '13.0895.252、-5.8595.68 '12.79105.789、-6.1771.089- 9.68116.123、-10.8030.79 '3.291212.108-12.4775.10-'6.27。本發(fā)明的第一優(yōu)選技術(shù)方案為，優(yōu)選的保留時(shí)間和峰面積為
峰號(hào)保留時(shí)間min峰面積％12.131 々.17241.4796 44.988822.436 々.6230.9179--2.647732.582 々.8231.0205--2.554343.099 ,3.3531.0205--5.816453.349 3.8514.1021--9.954063.845-4.1094.7702--10.503974.066 ,4.2583.1365--3.668984.206 ,5.3313.0414--13.071195.252 5.8595.6871--12.7867105.789 ,6.1771.089 9.6784116.123--10.8030.7959-一 3.28171212.108 12.4775.1068-一6.2657。本發(fā)明的第二優(yōu)選技術(shù)方案為，促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素的數(shù)均分子量為10685道爾頓， 重均分子量為11350道爾頓。本發(fā)明的第三優(yōu)選技術(shù)方案為，促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素含有18種氨基酸，氨基酸的名稱及重量百分比含量為=Asp 1. 5%, ThrO. 3%, SerO. 7%, Glu 3. 6%, Pro 0. 9%, Glyl. 2%,Ala 1. 2%, CysO. 2%, Val 0. 9%, Met 0. 5%, Ile 0. 9%, Leul. 8%, Tyr 0.4%, Phr 0. 9%,His 0. 7%,Try 2. 5%,Lys 1. 5%,Arg 9. 1 %，總量占 28. 8%。其中，氨基酸的檢測(cè)方法采用高效液相色譜檢測(cè)。本發(fā)明的第四優(yōu)選技術(shù)方案為，促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素的微量元素包括狗7.3 7. 6ug/ml，SeO. 04 0. 05ug/ml，Mgl40. 5 140. 7ug/ml，Zn 14. 2 14. 4ug/ml，Na 33. 5 33. 7ug/ml, Ca 0. 3 0. 5ug/ml，Mn 0. 6 0. 7ug/ml, Co 200. 1 200. 3ug/ml。本發(fā)明中微量元素的檢測(cè)方法通過(guò)原子吸收光譜檢測(cè)。本發(fā)明的第五優(yōu)選技術(shù)方案為，促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素的濃度為15. 0 22. 5mg/ml，優(yōu)選15. 0 21. 7mg/ml，測(cè)定方法為福林酚法。本發(fā)明的第四優(yōu)選技術(shù)方案為，促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素中活性組份的重量占總重量的 71 % 75%。其中，活性蛋白的測(cè)量方法為促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素通過(guò)凝膠色譜等方法分離，經(jīng) 7721細(xì)胞摻入培養(yǎng)，通過(guò)MTT法測(cè)定活性組份，并計(jì)算活性組份重量的占總質(zhì)量的比例。本發(fā)明的第五優(yōu)選技術(shù)方案為，所述的促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素在體外促7721細(xì)胞的增殖試驗(yàn)中，用MTT法測(cè)定的增殖倍數(shù)為4. 5 6. 0。本發(fā)明還涉及一種所述的促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素的制劑，所述的制劑包括凍干粉針。本發(fā)明還對(duì)提取得到的促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素進(jìn)一步制備成了制劑，其中包括粉針劑；凍干粉針劑的配方為促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素10重量份，賦形劑甘露醇1 100重量份； 其中優(yōu)選促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素10重量份，賦形劑10 100重量份，更優(yōu)選促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素10 重量份，賦形劑40 100重量份。其中，賦形劑選自甘露醇、山梨醇、葡萄糖、右旋糖酐、木糖醇等，所述的凍干粉針中還可以包括穩(wěn)定劑、防腐劑、抗氧化劑等，輔料的選擇可依據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員的常規(guī)選擇進(jìn)行，也可以通過(guò)處方篩選實(shí)驗(yàn)獲得。本發(fā)明的凍干粉針可采用已知的方法制備。本發(fā)明制備的凍干針劑，通過(guò)動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)、體外實(shí)驗(yàn)的檢測(cè)，其活性與所提取的促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素的活性相同。本發(fā)明還涉及所述的促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素在制備治療重型肝炎、慢性活動(dòng)性肝炎或肝硬化藥物中的應(yīng)用。下面對(duì)本發(fā)明的內(nèi)容做進(jìn)一步的解釋和說(shuō)明本發(fā)明中促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素的制備方法的工藝步驟為(1)選材原材料選用當(dāng)天宰殺的新鮮乳豬肝；(2)組織處理乳豬肝除去筋膜、結(jié)蒂等組織后，用純水洗凈；(3)室溫下與注射用水混合，勻漿的速度為800 1000轉(zhuǎn)/分，勻漿液冷凍至-20°C -35°C ；(4)將_20°C _35°C凍存至少7天的勻漿液解凍后，加熱至83°C 85°C后立刻撤掉加熱源，放入濾布或?yàn)V網(wǎng)自然過(guò)濾，濾液用NaOH溶液調(diào)節(jié)PH值至6. 5 ；(5)將調(diào)節(jié)至PH為6. 5的溶液用截留分子量20000的中空纖維柱過(guò)濾，然后經(jīng)截留分子量10000的超濾膜過(guò)濾，超濾液冷凍至-20°c -30°c密封保存；(6)將凍存至少7天的超濾液解凍，過(guò)濾，上清液用反滲透膜濃縮至原體積的 1/3 1/2，濃縮液經(jīng)截留分子量10000的中空纖維柱過(guò)濾，再經(jīng)0. 22um的濾膜除菌后分裝，-18°C以下保存。
具體的要求及技術(shù)優(yōu)勢(shì)為(1)選材原材料選用當(dāng)天宰殺的新鮮乳豬肝；單個(gè)的完整乳豬肝不得超過(guò)140 克，實(shí)驗(yàn)證實(shí)，乳豬的肝臟的促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素的活性組份含量更高，大大高于成年豬的含量；(2)組織處理乳豬肝除去筋膜、結(jié)蒂等組織后，用純水洗凈；并用不銹鋼刀切成 2 3塊，以便于勻漿；(3)室溫下與注射用水混合，勻漿的速度為800 1000轉(zhuǎn)/分，時(shí)間為5分鐘，比例優(yōu)選為水豬肝質(zhì)量比為1. 1 1 ；勻漿液冷凍至-20 -35°c ；勻漿液以10 18°C / min的速度從室溫冷凍至0 -5°C，再以4 8°C /min的速度冷凍至_20 _35°C，優(yōu)選勻漿液以12 15°C /min的速度從室溫冷凍至0 _5°C，再以3 6°C /min的速度冷凍至-20 -35°C/min。本發(fā)明此處采用了分步快速速凍的方式，發(fā)明人通過(guò)反復(fù)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)， 通過(guò)分步冷凍的勻漿液，促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素的得率會(huì)有所提高。這可能是由于通過(guò)對(duì)冷凍速度的控制，使勻漿液冷凍產(chǎn)生顆粒大小適宜的冰晶，從而在細(xì)胞內(nèi)更加徹底的破壞細(xì)胞膜， 釋放出細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)，使得提取液中有效成分含量大大增加?，F(xiàn)有技術(shù)中，采用速凍的方式冷凍的，都是采用同一速度降溫的，但如果降溫速度一直保持很快，就會(huì)產(chǎn)生比較大的冰晶， 也對(duì)細(xì)胞膜的破壞不完全，從而使細(xì)胞內(nèi)的物質(zhì)的釋放不完全，造成提取率低下。而且如果速凍速度過(guò)快，對(duì)設(shè)備和工藝的要求很高，一般設(shè)備難以達(dá)到。(4)將-10 _25°C凍存至少7天的勻漿液解凍后，加熱至83°C 85°C后立刻撤掉加熱源，放入濾布或?yàn)V網(wǎng)自然過(guò)濾，濾布或?yàn)V網(wǎng)的孔徑0. 1mm，濾布或?yàn)V網(wǎng)的面積為2 3平方米，速度200ml/min，濾液用NaOH溶液調(diào)節(jié)PH值至6. 5 ；本發(fā)明采用了達(dá)到83°C 85°C 后立刻撤掉加熱源，從而進(jìn)一步保證了產(chǎn)品的活性。解凍和加熱的速度為1 10°C /min, 并優(yōu)選階段式升溫的方式，優(yōu)選以1 2V /min的速度升溫至0 5°C，再以4 8°C /min 的速度加熱至83°C 85°C。階段式升溫的好處為先以較慢的速度升溫至零度左右，對(duì)于冷凍體，升溫速度過(guò)快，會(huì)造成冷凍體內(nèi)部和外部的溫差增大，緩慢升溫可以使冷凍體均勻緩慢的解凍。因?yàn)樵诓僮鬟^(guò)程中一般采用蒸汽加熱，避免了在蒸汽加熱過(guò)程中，外層解凍融化溫度增高，內(nèi)層還未融化，外層的溶液在高溫作用下活性降低的可能。當(dāng)冷凍體溶解，本發(fā)明采用了較快速升溫的過(guò)程，這是因?yàn)?，如果解凍后還采用較慢的速度，冷凍后的勻漿液中由于細(xì)胞分解破裂，釋放出大量的具有活性的蛋白分解酶，此類(lèi)活性酶物質(zhì)在一個(gè)較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)處于一種適于其酶解其他物質(zhì)的環(huán)境中，從而會(huì)引起其促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素活性物質(zhì)的降解。(5)將調(diào)節(jié)至PH為6. 5的溶液用截留分子量20000的中空纖維柱過(guò)濾，然后經(jīng)截留分子量10000的超濾膜過(guò)濾，超濾液冷凍至-20°c -30°c密封保存；此處的冷凍也采用了分步冷凍，超濾液以10 15°C /min的速度從室溫冷凍至0 _5°C，再以2 6°C /min 的速度冷凍至-20 _30°C，優(yōu)選超濾液以12 15°C的速度從室溫冷凍至0 _5°C，再以 3 5°C /min的速度冷凍至_20 _30°C /min ；其中，中空纖維柱過(guò)濾的壓力不超過(guò)2. 3kg， 截留分子量10000的超濾膜的壓力不超過(guò)2. 5kgo(6)將凍存至少7天的超濾液解凍，解凍的速度為1 10°C /min,優(yōu)選以1 4°C / min的速度升溫至室溫；過(guò)濾，上清液用反滲透膜濃縮至原體積的三分之一，濃縮液經(jīng)截留分子量10000的中空纖維柱過(guò)濾，再經(jīng)0. 22um的濾膜除菌后分裝于不銹鋼桶中，-18°C以下
7保存。在現(xiàn)有技術(shù)中，一般采用反復(fù)凍融的方式，對(duì)促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素進(jìn)行提取，然而，反復(fù)凍融易產(chǎn)生降壓物質(zhì)，在對(duì)用藥的安全產(chǎn)生隱患。而采用化學(xué)提取、酶提取法，由于在提取過(guò)程中，PH變化過(guò)大或者酶的作用，最終提取得到的促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素的活性偏低，基本無(wú)臨床效果。本發(fā)明采用了兩次凍融、低溫長(zhǎng)時(shí)間冷凍的方式，最終制備得到了一種活性多肽含量高、產(chǎn)品得率高的促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素，經(jīng)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床試驗(yàn)，得到了良好的治療效果。本發(fā)明采用的工藝流程為勻漿液分步冷凍、凍存至少7天-溶解、加熱至83 85°C、調(diào)pH值-分子量20，000中空纖維柱過(guò)濾、分子量10，000超濾膜過(guò)濾-分步冷凍、凍存至少7天-溶解、濃縮-分子量20，000中空纖維柱過(guò)濾-0. 22 μ m除菌過(guò)率；1.本發(fā)明的工藝流程中，先將勻漿液分步冷凍，并凍存至少7天后溶解加熱后，濾布易于過(guò)濾。凍存7天可使細(xì)胞充分破裂，從而使蛋白、多肽等物質(zhì)釋放，從而可使一次冷凍達(dá)到反復(fù)凍融的目的，避免了降壓物質(zhì)的產(chǎn)生。2.本發(fā)明熱變性步驟中，僅加熱至83 85°C并立即撤掉熱源，本發(fā)明通過(guò)反復(fù)試驗(yàn)確定，采用這種方式即可以使大分子蛋白變性，而加熱至更高的溫度或者在85°C這一度下保溫，都會(huì)對(duì)降低本發(fā)明活性物質(zhì)的活性。3.本發(fā)明對(duì)勻漿液采用的是自然過(guò)濾的方式，避免了離心等操作對(duì)本發(fā)明活性物質(zhì)的活性的影響，節(jié)約能源。4.本發(fā)明采用了在對(duì)溶液進(jìn)行過(guò)濾前就調(diào)節(jié)PH的做法。5.本發(fā)明采用了對(duì)溶液先采用截留分子量20000的中空纖維柱過(guò)濾，再采用截留分子量10000的超濾膜過(guò)濾，并對(duì)中空纖維柱過(guò)濾的壓力和超濾膜的壓力進(jìn)行了控制，可防止極少量的高分子物質(zhì)通過(guò)濾膜，也可防止膜的損壞。6.本發(fā)明對(duì)超濾液再進(jìn)行一次冷凍、解凍、過(guò)濾，從而進(jìn)一步去除最終產(chǎn)品中的高分子物質(zhì)，再經(jīng)除菌得到一種安全的產(chǎn)品。


圖1為實(shí)施例1制備的促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素的高效液相色譜圖；圖2為實(shí)施例2制備的促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素的高效液相色譜圖；圖3為實(shí)施例3制備的促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素的高效液相色譜圖；圖4為實(shí)施例4制備的促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素的高效液相色譜圖；圖5為實(shí)施例5制備的促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素的高效液相色譜圖；圖6為實(shí)施例6制備的促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素的高效液相色譜圖；圖7為實(shí)施例7制備的促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素的高效液相色譜圖。本發(fā)明的具體實(shí)施方式
僅限于進(jìn)一步解釋和說(shuō)明本發(fā)明，并不對(duì)本發(fā)明的內(nèi)容構(gòu)成限制。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素的提取(1)選材原材料選用當(dāng)天宰殺的新鮮乳豬肝；單個(gè)完整豬肝的重量不得超過(guò)140 克；(2)組織處理乳豬肝除去筋膜、結(jié)蒂等組織后，用純水洗凈；并用不銹鋼刀切成2 3塊，以便于勻漿；(3)室溫下與注射用水混合，勻漿的速度為800 1000轉(zhuǎn)/分，時(shí)間為5min，比例為水豬肝質(zhì)量比為1. 1 1 ；勻漿液以16°c /min內(nèi)從室溫冷凍至0°C，再以4°C /min的速度冷凍至-35 °C ；(4)將-10 _25°C凍存至少7天的勻漿液解凍后，加熱至83°C 85°C后立刻撤掉加熱源，放入濾布自然過(guò)濾，濾液用NaOH溶液調(diào)節(jié)PH值至6. 5，解凍和加熱的速度為1 2 0C /min ；(5)將調(diào)節(jié)至PH為6. 5的溶液用截留分子量20000的中空纖維柱過(guò)濾，然后經(jīng)截留分子量10000的超濾膜過(guò)濾，超濾液以15°C /min的速度從室溫冷凍至_5°C，再以5°C / min的速度冷凍至_25°C。其中，中空纖維柱過(guò)濾的壓力不超過(guò)2. 3kg，截留分子量10000的超濾膜的壓力不超過(guò)2. 5kgo(6)將凍存至少7天的超濾液解凍，解凍的速度為1°C /min的速度升溫至室溫；過(guò)濾，上清液用反滲透膜濃縮至原體積的三分之一，濃縮液經(jīng)截留分子量10000的中空纖維柱過(guò)濾，再經(jīng)0. 22um的濾膜除菌后分裝于不銹鋼桶中，-18°c以下保存。將制備得到的促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素溶液用高效液相色譜法分析，條件為流動(dòng)相甲醇水=10 90(體積比)，色譜柱 hypersilODS4. 6X300mm(5um)，波長(zhǎng) 256nm，流速 0. Sml/min，共有12個(gè)色譜組分峰，其高效液相色譜圖如圖1所示。經(jīng)檢測(cè)，所制備的促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素含有18種氨基酸，氨基酸的名稱及重量百分比含量為Asp 1. 5%, ThrO. 3%, SerO. 7%, Glu 3. 6%, Pro 0. 9%, Glyl. 2%, Ala 1. 2%, CysO. 2%, Val 0. 9%, Met 0. 5%, lie 0.9%, Leul. 8%, Tyr 0.4%, Phr 0. 9%, His 0. 7%, Try 2. 5%, Lys 1. 5%, Arg 9. 1%，總量占 28. 8% ；微量元素的含量為Fe 7. 6ug/ml，Se 0. 04ug/ml，Mg 140. 5ug/ml，Zn 14. 2ug/ml, Na 33. 5ug/ml, Ca 0. 3ug/ml, Mn 0. 6ug/ml, Co 200.lug/ml ；促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素的濃度為20. 3mg/ml ；促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素中活性組份的重量占總重量的71%。實(shí)施例2(1)選材原材料選用當(dāng)天宰殺的新鮮乳豬肝；單個(gè)完整豬肝的重量不得超過(guò)140 克；(2)組織處理乳豬肝除去筋膜、結(jié)蒂等組織后，用純水洗凈；并用不銹鋼刀切成 2 3塊，以便于勻漿；(3)室溫下與注射用水混合，勻漿的速度為800 1000轉(zhuǎn)/分，時(shí)間為5分鐘，比例為水豬肝質(zhì)量比為1. 15 1;勻漿液以15°C/min的速度從室溫冷凍至-5°C，再以5°C/ min的速度冷凍至-35 °C。(4)將_35°C凍存至少7天的勻漿液解凍后，加熱至83°C 85°C后立刻撤掉加熱源，放入濾布自然過(guò)濾，濾液用NaOH溶液調(diào)節(jié)PH值至6. 5 ；解凍和加熱的速度以2°C /min 的速度升溫至0°C，再以8°C /min的速度加熱至85°C ；(5)將調(diào)節(jié)至PH為6. 5的溶液用截留分子量20000的中空纖維柱過(guò)濾，然后經(jīng)截留分子量10000的超濾膜過(guò)濾，超濾液以12°C /min的速度從室溫冷凍至_5°C，再以3°C / min的速度冷凍至_30°C ；其中，中空纖維柱過(guò)濾的壓力不超過(guò)2. 3kg，截留分子量10000的超濾膜的壓力不超過(guò)2. 5kg；(6)將凍存至少7天的超濾液解凍，解凍的速度為T(mén)C /min升溫至室溫；過(guò)濾， 上清液用反滲透膜濃縮至原體積的三分之一，濃縮液經(jīng)截留分子量10000的中空纖維柱過(guò)濾，再經(jīng)0. 22um的濾膜除菌后分裝于不銹鋼桶中，-18°c以下保存。將制備得到的促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素溶液用高效液相色譜法分析，條件為流動(dòng)相甲醇水=10 90(體積比)，色譜柱 hypersilODS4. 6X300mm(5um)，波長(zhǎng) 256nm，流速 0. Sml/min，共有12個(gè)色譜組分峰，其高效液相色譜圖如圖2所示。經(jīng)檢測(cè)，所制備的促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素含有18種氨基酸，氨基酸的名稱及重量百分比含量為Asp 1. 5%, ThrO. 3%, SerO. 7%, Glu 3. 6%, Pro 0. 9%, Glyl. 2%, Ala 1. 2%, CysO. 2%, Val 0. 9%, Met 0. 5%, lie 0. 9%, Leul. 8%, Tyr 0.4%, Phr 0. 9%, His 0. 7%, Try 2. 5%, Lys 1. 5%, Arg 9. 1%，總量占 28. 8% ；微量元素的含量為Fe 7. 3ug/ml，Se 0. 05ug/ml，Mg 140. 6ug/ml，Zn 14. 4ug/ml, Na 33. 7ug/ml, Ca 0. 5ug/ml, Mn 0. 7ug/ml, Co 200.2ug/ml ；促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素的濃度為21. 5 ；促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素中活性組份的重量占總重量的71%。實(shí)施例3(1)選材原材料選用當(dāng)天宰殺的新鮮乳豬肝；單個(gè)完整豬肝的重量不得超過(guò)140 克；(2)組織處理乳豬肝除去筋膜、結(jié)蒂等組織后，用純水洗凈；并用不銹鋼刀切成 2 3塊，以便于勻漿；(3)室溫下與注射用水混合，勻漿的速度為800 1000轉(zhuǎn)/分，時(shí)間為5分鐘，水和豬肝質(zhì)量比為1. 1 1 ；勻漿液以18°c /min的速度從室溫冷凍至_2°C，再以8°C /min的速度冷凍至；(4)將-30°C凍存至少7天的勻漿液解凍后，加熱至83°C后立刻撤掉加熱源，放入濾布自然過(guò)濾，濾液用NaOH溶液調(diào)節(jié)PH值至6. 5 ；(5)將調(diào)節(jié)至PH為6. 5的溶液用截留分子量20000的中空纖維柱過(guò)濾，然后經(jīng)截留分子量10000的超濾膜過(guò)濾，超濾液以10°C /min的速度從室溫冷凍至_4°C，再以4°C / min的速度冷凍至_25°C ；其中，中空纖維柱過(guò)濾的壓力不超過(guò)2. 3kg，截留分子量10000的超濾膜的壓力不超過(guò)2. 5kg；(6)將凍存至少7天的超濾液解凍，解凍的速度為1 10°C /min,優(yōu)選以1 4°C / min的速度升溫至室溫；過(guò)濾，上清液用反滲透膜濃縮至原體積的三分之一，濃縮液經(jīng)截留分子量10000的中空纖維柱過(guò)濾，再經(jīng)0. 22um的濾膜除菌后分裝于不銹鋼桶中，-18°C以下保存。將制備得到的促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素溶液用高效液相色譜法分析，條件為流動(dòng)相甲醇水=10 90(體積比)，色譜柱 hypersilODS4. 6X300mm(5um)，波長(zhǎng) 256nm，流速 0. Sml/min，共有12個(gè)色譜組分峰，其高效液相色譜圖如圖3所示；經(jīng)檢測(cè)，所制備的促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素含有18種氨基酸，氨基酸的名稱及重量百分比含量為Asp 1. 5%, ThrO. 3%, SerO. 7%, Glu 3. 6%, Pro 0. 9%, Glyl. 2%, Ala 1. 2%, CysO. 2%, Val 0. 9%, Met 0. 5%, lie 0.9%, Leul. 8%, Tyr 0.4%, Phr 0. 9%, His0. 7%, Try 2. 5%, Lys 1. 5%, Arg 9. 1%，總量占 28. 8% ；微量元素的含量為Fe 7. 5ug/ml，Se 0. 05ug/ml，Mg 140. 7ug/ml，Zn 14. 3ug/ml, Na 33. 6ug/ml, Ca 0. 4ug/ml, Mn 0. 7ug/ml, Co 200.3ug/ml ；促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素的濃度為20. 8mg/ml ；促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素中活性組份的重量占總重量的72%。實(shí)施例4(1)選材原材料選用當(dāng)天宰殺的新鮮乳豬肝；單個(gè)完整豬肝的重量不得超過(guò)140 克；(2)組織處理乳豬肝除去筋膜、結(jié)蒂等組織后，用純水洗凈；并用不銹鋼刀切成 2 3塊，以便于勻漿；(3)室溫下與注射用水混合，勻漿的速度為800 1000轉(zhuǎn)/分，時(shí)間為5分鐘，水和豬肝質(zhì)量比為1. 1 1 ；勻漿液以15°c /min的速度從室溫冷凍至_5°C，再以5°C /min的速度冷凍至_30°C ；(4)將_30°C凍存至少7天的勻漿液解凍后，加熱至83°C后立刻撤掉加熱源，放入濾布自然過(guò)濾，濾液用NaOH溶液調(diào)節(jié)PH值至6. 5 ；(5)將調(diào)節(jié)至PH為6. 5的溶液用截留分子量20000的中空纖維柱過(guò)濾，然后經(jīng)截留分子量10000的超濾膜過(guò)濾，超濾液以12°C /min的速度從室溫冷凍至_4°C，再以4°C / min的速度冷凍至_25°C ；其中，中空纖維柱過(guò)濾的壓力不超過(guò)2. 3kg，截留分子量10000的超濾膜的壓力不超過(guò)2. 5kg；(6)將凍存至少7天的超濾液解凍，解凍的速度為1 10°C /min,優(yōu)選以1 4°C / min的速度升溫至室溫；過(guò)濾，上清液用反滲透膜濃縮至原體積的三分之一，濃縮液經(jīng)截留分子量10000的中空纖維柱過(guò)濾，再經(jīng)0. 22um的濾膜除菌后分裝于不銹鋼桶中，-18°C以下保存。將制備得到的促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素溶液用高效液相色譜法分析，條件為流動(dòng)相甲醇水=10 90(體積比)，色譜柱 hypersilODS4. 6X300mm(5um)，波長(zhǎng) 256nm，流速 0. Sml/min，共有12個(gè)色譜組分峰，其高效液相色譜圖如圖4所示。經(jīng)檢測(cè)，所制備的促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素含有18種氨基酸，氨基酸的名稱及重量百分比含量為Asp 1. 5%, ThrO. 3%, SerO. 7%, Glu 3. 6%, Pro 0. 9%, Glyl. 2%, Ala 1. 2%, CysO. 2%, Val 0. 9%, Met 0. 5%, lie 0.9%, Leul. 8%, Tyr 0.4%, Phr 0. 9%, His 0. 7%, Try 2. 5%, Lys 1. 5%, Arg 9. 1%，總量占 28. 8% ；微量元素的含量為Fe 7. 5ug/ml，Se 0. 05ug/ml，Mg 140. 7ug/ml，Zn 14. 3ug/ml, Na 33. 6ug/ml, Ca 0. 4ug/ml, Mn 0. 7ug/ml, Co 200.3ug/ml ；促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素的濃度為21. 2mg/ml ；促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素中活性組份的重量占總重量的73%。實(shí)施例5(1)選材原材料選用當(dāng)天宰殺的新鮮乳豬肝；單個(gè)完整豬肝的重量不得超過(guò)140 克；(2)組織處理乳豬肝除去筋膜、結(jié)蒂等組織后，用純水洗凈；并用不銹鋼刀切成 2 3塊，以便于勻漿；
(3)室溫下與注射用水混合，勻漿的速度為800 1000轉(zhuǎn)/分，時(shí)間為5分鐘，水和豬肝質(zhì)量比為1. 1 1 ；勻漿液以15°c /min的速度從室溫冷凍至_5°C，再以6°C /min的速度冷凍至_30°C ；(4)將-30°c凍存至少7天的勻漿液解凍后，加熱至83°C后立刻撤掉加熱源，放入濾布自然過(guò)濾，濾液用NaOH溶液調(diào)節(jié)PH值至6. 5 ；(5)將調(diào)節(jié)至PH為6. 5的溶液用截留分子量20000的中空纖維柱過(guò)濾，然后經(jīng)截留分子量10000的超濾膜過(guò)濾，超濾液以12°C /min的速度從室溫冷凍至_4°C，再以5°C / min的速度冷凍至_25°C ；其中，中空纖維柱過(guò)濾的壓力不超過(guò)2. 3kg，截留分子量10000的超濾膜的壓力不超過(guò)2. 5kg；(6)將凍存至少7天的超濾液解凍，解凍的速度為4°C /min的速度升溫至室溫；過(guò)濾，上清液用反滲透膜濃縮至原體積的三分之一，濃縮液經(jīng)截留分子量10000的中空纖維柱過(guò)濾，再經(jīng)0. 22um的濾膜除菌后分裝于不銹鋼桶中，-18°c以下保存。將制備得到的促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素溶液用高效液相色譜法分析，條件為流動(dòng)相甲醇水=10 90(體積比)，色譜柱 hypersilODS4. 6X300mm(5um)，波長(zhǎng) 256nm，流速 0. Sml/min，共有12個(gè)色譜組分峰，其高效液相色譜圖如圖5所示。經(jīng)檢測(cè)，所制備的促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素含有18種氨基酸，氨基酸的名稱及重量百分比含量為Asp 1. 5%, ThrO. 3%, SerO. 7%, Glu 3. 6%, Pro 0. 9%, Glyl. 2%, Ala 1. 2%, CysO. 2%, Val 0. 9%, Met 0. 5%, lie 0.9%, Leul. 8%, Tyr 0.4%, Phr 0. 9%, His 0. 7%, Try 2. 5%, Lys 1. 5%, Arg 9. 1%，總量占 28. 8% ；微量元素的含量為Fe 7. 5ug/ml，Se 0. 05ug/ml，Mg 140. 7ug/ml，Zn 14. 3ug/ml, Na 33. 6ug/ml, Ca 0. 4ug/ml, Mn 0. 7ug/ml, Co 200.3ug/ml ；促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素的濃度為20. 5mg/ml ；促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素中活性組份的重量占重量的72%。實(shí)施例6(1)選材原材料選用當(dāng)天宰殺的新鮮乳豬肝；單個(gè)完整豬肝的重量不得超過(guò)140 克；(2)組織處理乳豬肝除去筋膜、結(jié)蒂等組織后，用純水洗凈；并用不銹鋼刀切成 2 3塊，以便于勻漿；(3)室溫下與注射用水混合，勻漿的速度為1000轉(zhuǎn)/分，時(shí)間為5分鐘，水和豬肝質(zhì)量比為1. 2 1 ；勻漿液以18°C /min的速度從室溫冷凍至_5°C，再以5°C /min的速度冷凍至-32°C ；(4)將-30°C凍存至少7天的勻漿液解凍后，加熱至84°C后立刻撤掉加熱源，放入濾布自然過(guò)濾，濾液用NaOH溶液調(diào)節(jié)PH值至6. 5 ；(5)將調(diào)節(jié)至PH為6. 5的溶液用截留分子量20000的中空纖維柱過(guò)濾，然后經(jīng)截留分子量10000的超濾膜過(guò)濾，超濾液以15°C /min的速度從室溫冷凍至_4°C，再以6V / min的速度冷凍至_25°C ；其中，中空纖維柱過(guò)濾的壓力不超過(guò)2. 3kg，截留分子量10000的超濾膜的壓力不超過(guò)2. 5kg；(6)將凍存至少7天的超濾液解凍，解凍的速度為3°C /min的速度升溫至室溫；過(guò)濾，上清液用反滲透膜濃縮至原體積的三分之一，濃縮液經(jīng)截留分子量10000的中空纖維柱過(guò)濾，再經(jīng)0. 22um的濾膜除菌后分裝于不銹鋼桶中，-18°C以下保存。將制備得到的促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素溶液用高效液相色譜法分析，條件為流動(dòng)相甲醇水=10 90(體積比)，色譜柱 hypersilODS4. 6X300mm(5um)，波長(zhǎng) 256nm，流速 0. Sml/min，共有12個(gè)色譜組分峰，其高效液相色譜圖如圖6所示。經(jīng)檢測(cè)，所制備的促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素含有18種氨基酸，氨基酸的名稱及重量百分比含量為Asp 1. 5%, ThrO. 3%, SerO. 7%, Glu 3. 6%, Pro 0. 9%, Glyl. 2%, Ala 1. 2%, CysO. 2%, Val 0. 9%, Met 0. 5%, lie 0.9%, Leul. 8%, Tyr 0.4%, Phr 0. 9%, His 0. 7%, Try 2. 5%, Lys 1. 5%, Arg 9. 1%，總量占 28. 8% ；微量元素的含量為Fe 7. 5ug/ml，Se 0. 05ug/ml，Mg 140. 7ug/ml，Zn 14. 3ug/ml, Na 33. 6ug/ml, Ca 0. 4ug/ml, Mn 0. 7ug/ml, Co 200.3ug/ml ；促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素的濃度為21. 7mg/ml ；促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素中活性組份的重量占總重量的71%。實(shí)施例7(1)選材原材料選用當(dāng)天宰殺的新鮮乳豬肝；單個(gè)完整豬肝的重量不得超過(guò)140 克；(2)組織處理乳豬肝除去筋膜、結(jié)蒂等組織后，用純水洗凈；并用不銹鋼刀切成 2 3塊，以便于勻漿；(3)室溫下與注射用水混合，勻漿的速度為800 1000轉(zhuǎn)/分，時(shí)間為5分鐘，水和豬肝質(zhì)量比為1. 15 1 ；勻漿液以17°C /min的速度從室溫冷凍至_5°C，再以7°C /min 的速度冷凍至_30°C ；(4)將_30°C凍存至少7天的勻漿液解凍后，加熱至83°C后立刻撤掉加熱源，放入濾布自然過(guò)濾，濾液用NaOH溶液調(diào)節(jié)PH值至6. 5 ；(5)將調(diào)節(jié)至PH為6. 5的溶液用截留分子量20000的中空纖維柱過(guò)濾，然后經(jīng)截留分子量10000的超濾膜過(guò)濾，超濾液以15°C /min的速度從室溫冷凍至_4°C，再以6V / min的速度冷凍至_25°C ；其中，中空纖維柱過(guò)濾的壓力不超過(guò)2. 3kg，截留分子量10000的超濾膜的壓力不超過(guò)2. 5kg；(6)將凍存至少7天的超濾液解凍，解凍的速度為4°C /min的速度升溫至室溫；過(guò)濾，上清液用反滲透膜濃縮至原體積的三分之一，濃縮液經(jīng)截留分子量10000的中空纖維柱過(guò)濾，再經(jīng)0. 22um的濾膜除菌后分裝于不銹鋼桶中，-18°c以下保存。將制備得到的促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素溶液用高效液相色譜法分析，條件為流動(dòng)相甲醇水=10 90(體積比)，色譜柱 hypersilODS4. 6X300mm(5um)，波長(zhǎng) 256nm，流速 0. Sml/min，共有12個(gè)色譜組分峰，其高效液相色譜圖如圖7所示。經(jīng)檢測(cè)，所制備的促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素含有18種氨基酸，氨基酸的名稱及重量百分比含量為Asp 1. 5%, ThrO. 3%, SerO. 7%, Glu 3. 6%, Pro 0. 9%, Glyl. 2%, Ala 1. 2%, CysO. 2%, Val 0. 9%, Met 0. 5%, lie 0.9%, Leul. 8%, Tyr 0.4%, Phr 0. 9%, His 0. 7%, Try 2. 5%, Lys 1. 5%, Arg 9. 1%，總量占 28. 8% ；微量元素的含量為 Fe 7. 5ug/ml, Se 0. 05ug/ml, Mg 140. 7ug/ml, Zn 14. 3ug/ml, Na 33. 6ug/ml, Ca 0. 4ug/ml, Mn 0. 7ug/ml, Co 200.3ug/ml ；促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素的濃度為20. 5mg/ml ；
促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素中活性組份的重量占總重量的71%。實(shí)施例8配方為實(shí)施例1提取得到的促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素10重量份，甘露醇90重量份，采用常規(guī)方法配液、除菌、灌裝，凍干。比較例1 不同的制備工藝處理對(duì)生物活性的影響工藝1 其他工藝處理均與實(shí)施例1相同，除在步驟(4)加熱至85°C并保持15分鐘；工藝2 其他工藝處理均與實(shí)施例1相同，除在步驟(4)直接以2V /min的速度加熱至83°C 85°C ；工藝3 其他工藝處理均與實(shí)施例1相同，除在步驟(4)直接以6°C /min的速度加熱至83°C 85°C ；檢測(cè)方法同實(shí)驗(yàn)例3，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表1所示表1:
實(shí)施例 130.3735.8
工藝 130.1393.5
工藝 230.1383.4
工藝 330.1383.4比較例2 不同的制備工藝處理對(duì)產(chǎn)率的影響工藝1 其他工藝處理與實(shí)施例1相同，在步驟(3)中，勻漿液以30°C /min的速度從室溫冷凍至-35 °C ；工藝2 其他工藝處理與實(shí)施例1相同，在步驟(3)中，勻漿液以10°C /min的速度從室溫冷凍至-35 °C ；工藝4 其他工藝處理與實(shí)施例1相同，在步驟(5)中，勻漿液以15°C /min的速度從室溫冷凍至-25 °C ；工藝5 其他工藝處理與實(shí)施例1相同，在步驟(5)中，勻漿液以5°C /min的速度從室溫冷凍至-25 °C /min ；工藝6 其他工藝處理與實(shí)施例1相同，在步驟(4)和步驟(6)中，凍存48小時(shí)；工藝7 其他工藝處理與實(shí)施例1相同，在步驟(4)和步驟(6)中，凍存72小時(shí)；實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2:表2:單位產(chǎn)量(mg/g)實(shí)施例16.58工藝15.45工藝25.34工藝35.18工藝44.54工藝54.38工藝65.35工藝75.26實(shí)驗(yàn)例1體內(nèi)實(shí)驗(yàn)取實(shí)施例1 7制備的促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素作為實(shí)驗(yàn)藥品，進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)例1體內(nèi)實(shí)驗(yàn)取實(shí)施例1 7制備的促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素作為實(shí)驗(yàn)藥品，進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn)雄性Wistar大鼠，1；35 190g，在戊巴比妥鈉(％ig/100g體重)麻醉下進(jìn)行32% 的肝部分切除，術(shù)后4 6小時(shí)經(jīng)腹腔注射生理鹽水細(xì)1、本發(fā)明實(shí)施例1 7制備的促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素20mg，于30小時(shí)固定于肝右葉中下1/3處取材，Bouin’ s液固定，包埋切片，6u H. Ε.染色，有絲分裂計(jì)數(shù)，如表3所示表3:
動(dòng)物數(shù)有絲分裂百分率倍數(shù)P值對(duì)照組80.9440.166促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素實(shí)施例153.1150.5233.3<0.001促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素實(shí)施例253.4040.4943.7<0.001促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素實(shí)施例353.2570.4273.6<0.001促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素實(shí)施例453.3640.4993.6<0.001促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素實(shí)施例553.3710.5233.5<0.001促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素實(shí)施例653.4120.4873.7<0.001促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素實(shí)施例 53.4070.5043.6<0.001實(shí)驗(yàn)例2體外實(shí)驗(yàn)取實(shí)施例1 7制備的促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素作為實(shí)驗(yàn)藥品，進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn)雄性豚鼠200 300G，經(jīng)心臟采血致死，無(wú)菌取出心臟，沖洗后剪碎與100目尼龍網(wǎng)上輕研，過(guò)濾，用含10%胎牛血清1640培養(yǎng)液制備肝細(xì)胞懸液，細(xì)胞計(jì)數(shù)為5 7 X IO5個(gè) /ml,0. 2%臺(tái)盤(pán)藍(lán)染色活率為81%。當(dāng)成活率高于70%時(shí)進(jìn)行M孔板培養(yǎng)，每孔加Iml含血清1640培養(yǎng)液，37°C,5% CO2,培育4小時(shí)，吸取各孔上清液，正常對(duì)照組不加促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素，實(shí)驗(yàn)組每孔加含有40 μ g促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素的無(wú)血清1640培養(yǎng)液，24小時(shí)每孔加2uci 的3H-dTR, 7°C,5%C02,培育2. 5小時(shí)，分別收集各孔的細(xì)胞，用0. OlMPBS沖洗3次，涂于玻璃纖維濾紙片上，37°C干燥過(guò)夜，將紙片放入閃爍杯中，加閃爍液5ml，閃爍計(jì)數(shù)器測(cè)各樣品的CPM值。表4本發(fā)明促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素對(duì)體外肝細(xì)胞DNA3H-ClTR參入量的影響
孔數(shù)CPM值倍數(shù)P值對(duì)照組36565. 3空白組31579.2促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素實(shí)施例1327423. 65.5<0.001促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素實(shí)施例2329417. 45.9<0.001促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素實(shí)施例3330414. 66.1<0.001促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素實(shí)施例4326924. 45.4<0.001促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素實(shí)施例5328420.25.7<0.001促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素實(shí)施例6327423. 05.5<0.001促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素實(shí)施例 3299166.0<0.001實(shí)驗(yàn)例3體外實(shí)驗(yàn)MTT法1.取實(shí)施例1 7制備的促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素，用RPMI-1640培養(yǎng)液制成每Iml中含多肽IOOyg的溶液。2.用10%的小牛血培養(yǎng)液培養(yǎng)SMMC-7721細(xì)胞至對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期，用0. 25%胰蛋白酶-乙二胺四醋酸二鈉消化液消化，加10%小牛血清培養(yǎng)液稀釋至每Iml中含2. 5X IO4 5 X IO4個(gè)細(xì)胞，將上述細(xì)胞懸液在96孔細(xì)胞板上鋪板，每孔100 μ 1，其中3孔加10%小牛血清培養(yǎng)液100 μ 1作為空白對(duì)照，置37°C，5%二氧化碳飽和水汽培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 4小時(shí)使其貼壁。供試品組，每孔加供試品溶液100 μ 1，每批供試品均做3個(gè)孔，細(xì)胞對(duì)照組和空白對(duì)照組每孔分別加RPMI-1640培養(yǎng)液100 μ 1，置37°C，5%二氧化碳飽和水汽培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48小時(shí)，結(jié)束培養(yǎng)前4小時(shí)取出培養(yǎng)板，吸去培養(yǎng)液，每孔加入0. 01mol/L磷酸鹽緩沖液 (pH 7. 3)洗一次，然后再每孔中加入上述磷酸鹽緩沖液(ρΗ7· 3)100μ 1和MTT溶液20μ 1，
繼續(xù)培養(yǎng)。培養(yǎng)結(jié)束后，其吸出培養(yǎng)液，每孔加入100 μ 1 二甲基亞砜，搖勻，在酶標(biāo)儀上以 550nm的波長(zhǎng)處分別測(cè)定其吸收度A值；并計(jì)算刺激指數(shù)；其中刺激指數(shù)為(供試品組3孔吸收度平均值-空白對(duì)照組3孔吸收度平均值)與(對(duì)照組3孔吸收度平均值-空白對(duì)照組3孔吸收度平均值)的比值。
刺激指數(shù)=供試品組3孔吸收度平均值-空白對(duì)照組3孔吸收度平均值對(duì)照組3孔吸收度平均值-空白對(duì)照組3孔吸收度平均值
表5
孔數(shù)吸光度對(duì)照組30.114空白組30.060促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素實(shí)施例130.373促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素實(shí)施例230.352促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素實(shí)施例330.357促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素實(shí)施例430.362促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素實(shí)施例530.368促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素實(shí)施例630.373促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素實(shí)施例 30.368
刺激指數(shù)
5.8
5. 4 5. 5 5. 6 5. 7 5. 8 56. 5
1權(quán)利要求
1. 一種促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素，其特征在于，所述的促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素溶液采用高效液相色譜法分析，在分析條件為流動(dòng)相甲醇水的體積比為10 90，色譜柱hypersil ODS 4. 6X300mm(5um)，波長(zhǎng)256nm，流速0. 8ml/min，具有12個(gè)色譜組分峰，其保留時(shí)間和峰面積為
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素，其特征在于，其保留時(shí)間和峰面積為
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素，其特征在于，所述的促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素的數(shù)均分子量為10685道爾頓，重均分子量為11350道爾頓。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素，其特征在于，所述的促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素含有18種氨基酸，氨基酸的名稱及重量百分比含量為Asp 1.5%, ThrO. 3%, SerO. 7%, Glu 3. 6%, Pro 0. 9%, Glyl. 2%, Ala 1. 2%, CysO. 2%, Val 0. 9%, Met 0. 5%, lie 0. 9%, Leu 1. 8%, Tyr 0. 4%, Phr 0. 9%, His 0. 7%, Try 2. 5%, Lys 1. 5%, Arg 9. 1%，總量占 28. 8%。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素，其特征在于，所述的促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素的微量元素包括:Fe 7. 3 ~ 7. 6ug/ml, Se 0. 04 0. 05ug/ml, Mgl40. 5 140. 7ug/ml, Zn 14. 2 14. 4ug/ml, Na 33. 5 33. 7ug/ml, Ca 0· 3 0. 5ug/ml, Mn 0· 6 0. 7ug/ml, Co 200.1 200. 3ug/ml。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素，其特征在于，所述的促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素的濃度為 15. 0 22. 5mg/ml，優(yōu)選 15. 0 21. 7mg/ml。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素，其特征在于，所述的促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素中活性蛋白質(zhì)的含量為71% 75%。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素，其特征在于，所述的促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素在體外促7721細(xì)胞的增殖試驗(yàn)中，用MTT法測(cè)定的增殖倍數(shù)為4. 5 6. 0。
9.一種含有權(quán)利要求1所述的促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素的制劑，其特征在于，所述的制劑包括凍干粉針。
10.權(quán)利要求1所述的促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素在制備治療重型肝炎、慢性活動(dòng)性肝炎或肝硬化藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素，采用高效液相色譜法分析，具有12個(gè)色譜組分峰，所述的促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素的數(shù)均分子量為10685道爾頓，重均分子量為11350道爾頓數(shù)，并含有18種氨基酸和10種微量元素。本發(fā)明的促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素的濃度為15.0～22.5mg/ml，其中活性蛋白質(zhì)的含量為71％～75％。所述的促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素在體外促7721細(xì)胞的增殖試驗(yàn)中，用MTT法測(cè)定的增殖倍數(shù)為4.5～6.0。本發(fā)明還涉及該促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素的制劑及應(yīng)用。本發(fā)明的促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素活性高，有效物質(zhì)的含量高，使用安全。
文檔編號(hào)A61K38/00GK102294013SQ20111026473
公開(kāi)日2011年12月28日 申請(qǐng)日期2011年9月8日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月8日
發(fā)明者孔祥平, 張宜俊, 張海松, 楊富強(qiáng), 陳光明, 陳陽(yáng)述 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍第四五八醫(yī)院