專利名稱：利用rna干擾文庫篩選腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及的是一種利用RNA干擾文庫和免疫缺陷小鼠細胞在體移植腫瘤轉(zhuǎn)移模型篩選 腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因。
背景技術(shù)：
腫瘤轉(zhuǎn)移是指腫瘤細胞從原發(fā)部位擴散到機體其它部位的現(xiàn)象。統(tǒng)計表明，超過90%的 腫瘤患者死亡源于腫瘤轉(zhuǎn)移。腫瘤轉(zhuǎn)移包括1、腫瘤細胞遷移通過腫瘤組織基底膜；2、進 入循環(huán)系統(tǒng)，在其中存活并轉(zhuǎn)運；3、在腫瘤繼發(fā)部位滯留；4、從循環(huán)系統(tǒng)滲出；5、浸入 腫瘤繼發(fā)部位并增殖形成新的腫瘤等過程。由于其復雜性，盡管己對其進行了廣泛的研究， 腫瘤轉(zhuǎn)移仍然是迄今了解得最少的腫瘤生物學過程。腫瘤轉(zhuǎn)移這一復雜過程是由多種基因調(diào) 節(jié)的。其中有些基因促進腫瘤轉(zhuǎn)移的發(fā)生，叫做腫瘤轉(zhuǎn)移促進基因。多年來，利用各種基因 過表達手段，人們找到了一些腫瘤轉(zhuǎn)移促進基因，例如，Amf, Hgf/sf, TGF-p, MMP, UPA, p-catenin等。
另一類基因抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的發(fā)生，叫做腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因。通常，腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因能 抑制腫瘤轉(zhuǎn)移而對原發(fā)腫瘤生長無影響，在轉(zhuǎn)移病灶中常通過甲基化或轉(zhuǎn)錄翻譯后修飾等一 系列機制表現(xiàn)為表達下調(diào)。為了更好地了解腫瘤轉(zhuǎn)移，人們試圖進一步揭示腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基 因在腫瘤轉(zhuǎn)移發(fā)射過程中的作用。顯而易見，尋找腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因需要通過降低腫瘤轉(zhuǎn)移 抑制基因表達來實現(xiàn)。但是，由于沒有可靠的降低表達手段，長期以來只確定了非常有限的 腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因，目前只有NM23、 KNIl、 KISS1、 MKK4、 BrMSl、 Gasl等有限的基因 符合腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因的定義標準，其中最為明確的是NM23和KNI。從而使得對腫瘤轉(zhuǎn) 移抑制基因的研究、開發(fā)、利用無法進行，極大地限制了對腫瘤轉(zhuǎn)移的了解、診斷和治療。
美國科學家安德魯 法爾和克雷格 梅洛1998年發(fā)現(xiàn)了 RNA干擾機制，2006年他們兩 分享了諾貝爾生理學和醫(yī)學獎。 一項全新的技術(shù)在提出后短短幾年就得到諾貝爾獎的肯定， 足見RNA干擾在醫(yī)學領(lǐng)域的開創(chuàng)性意義和極大的應(yīng)用前景。這一可以使得基因在體降低表達
的機制，也為尋找腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因提供了條件。
最近，有人利用細胞離體培養(yǎng)模型和RNA干擾文庫進行腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因的篩選，一 些腫瘤細胞株在凝膠基質(zhì)上進行離體三維細胞培養(yǎng)時，迅速形成與原始細胞團分開的衛(wèi)星細胞集落。這一過程可以離體模擬腫瘤轉(zhuǎn)移的幾個關(guān)鍵步驟1、從腫瘤組織遷移出去；2、在 腫瘤繼發(fā)部位滯留；3、浸入腫瘤繼發(fā)部位并增殖形成新的腫瘤等。RNA干擾文庫使得人類 基因組的各種基因分別在腫瘤細胞株任意地降低表達。這樣，在腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因降低表達 的細胞，進行凝膠基質(zhì)離體三維細胞培養(yǎng)時，形成衛(wèi)星細胞集落的能力大大增強，通過克隆 形成衛(wèi)星細胞集落的基因可以確定新的腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因。這一篩選的優(yōu)點是1、部分地 模擬了腫瘤轉(zhuǎn)移的過程、操作相對簡單；2、由于RNA干擾文庫可以有效地降低腫瘤轉(zhuǎn)移抑 制基因，有利于腫瘤轉(zhuǎn)移的形成，從而有利于篩選到腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因。缺點是由于離體模 型不能完全模擬在體腫瘤轉(zhuǎn)移的各個環(huán)節(jié)和環(huán)境的影響，因而1、篩選到的候選基因只是 影響腫瘤轉(zhuǎn)移的部分過程，可能出現(xiàn)假陽性腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因；2、不能篩選到一些影響模 型未能模擬的腫瘤轉(zhuǎn)移環(huán)節(jié)的腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因。
也有人利用免疫缺陷小鼠細胞在體移植腫瘤轉(zhuǎn)移模型和基因過表達文庫進行腫瘤轉(zhuǎn)移促 進基因的篩選。由于腫瘤轉(zhuǎn)移是多種步驟的的在體過程，其復雜性是任何細胞模型所不能模 擬的。因而人們建立了在體研究腫瘤轉(zhuǎn)移的動物模型--免疫缺陷小鼠細胞異體移植模型。就 是將腫瘤細胞通過尾靜脈注入免疫缺陷小鼠(SCID小鼠)體內(nèi)，由于毛細血管豐富，腫瘤 細胞在肺部滯留并增殖形成新的腫瘤。這一過程可以在體模擬腫瘤轉(zhuǎn)移的幾個關(guān)鍵步驟 1、進入循環(huán)系統(tǒng)，在其中存活并轉(zhuǎn)運；2、在腫瘤繼發(fā)部位滯留；3、從循環(huán)系統(tǒng)滲出；4、 浸入腫瘤繼發(fā)部位并增殖形成新的腫瘤等。過表達文庫使得人類基因組的各種基因分別在腫 瘤細胞株任意地過表達，腫瘤轉(zhuǎn)移促進基因過表達細胞形成轉(zhuǎn)移的能力大大增強。這樣，在 對照細胞不能形成腫瘤轉(zhuǎn)移的條件下，過表達文庫處理的腫瘤細胞也形成了肺腫瘤。通過分 離肺腫瘤，并克隆肺腫瘤的過表達基因可以確定新的腫瘤轉(zhuǎn)移促進基因。這一篩選的優(yōu)點 是1、模擬了體內(nèi)腫瘤轉(zhuǎn)移的發(fā)生過程和環(huán)境；2、由于過表達升高腫瘤轉(zhuǎn)移促進基因，有 利于腫瘤轉(zhuǎn)移的形成，從而有利于篩選到腫瘤轉(zhuǎn)移促進基因。缺點是過表達升高腫瘤轉(zhuǎn)移抑 制基因后，不能形成腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因失活引起的腫瘤轉(zhuǎn)移，因而不利于篩選到腫瘤轉(zhuǎn)移抑 制基因。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，而提供一種利用免疫缺陷小鼠細胞在體移 植腫瘤轉(zhuǎn)移模型比細胞模型更好地模擬腫瘤轉(zhuǎn)移發(fā)生的優(yōu)勢，和RNA干擾文庫使得人類基因 組的各種基因分別在腫瘤細胞株任意地降低表達的優(yōu)勢，進行篩選腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因的方法。幾年來，通過利用人類基因組的RNA干擾文庫，結(jié)合免疫缺陷小鼠細胞異體移植模型發(fā) 明了一種腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因篩選的新技術(shù)，并率先進行了尤文氏肉瘤(Ewing' s sarcoma) 細胞的腫瘤肺轉(zhuǎn)移抑制基因篩選，確定了一批真正的腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因。
本發(fā)明的目的是通過如下技術(shù)方案來完成的，本發(fā)明利用免疫缺陷小鼠細胞在體移植腫 瘤轉(zhuǎn)移模型比細胞模型更好地模擬腫瘤轉(zhuǎn)移發(fā)生，利用RNA干擾文庫使得人類基因組的各種 基因分別在腫瘤細胞株任意地降低表達，使得其中腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因降低表達的細胞形成腫 瘤轉(zhuǎn)移的潛能大大增強，這樣，將RNA干擾文庫處理的細胞注入免疫缺陷小鼠體內(nèi)后，在對 照細胞不能形成腫瘤轉(zhuǎn)移的條件下，腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因降低表達的細胞可以形成肺腫瘤，通 過分離肺腫瘤，并克隆肺腫瘤內(nèi)的降低表達基因可以確定并篩選新的腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因。 本發(fā)明對所述腫瘤細胞進行如下表型篩選
a. 注入小量腫瘤細胞到免疫缺陷小鼠體內(nèi)后，對照和RNA文庫處理細胞都不形成肺腫 瘤；
b. 注入適量腫瘤細胞到免疫缺陷小鼠體內(nèi)后，對照細胞不形成肺腫瘤，而RNA文庫處理 細胞形成肺腫瘤；
c. 注入大量腫瘤細胞到免疫缺陷小鼠體內(nèi)后，對照和RNA文庫處理細胞都形成肺腫瘤， 兩者相比較，RNA文庫處理細胞形成更多肺腫瘤；
本發(fā)明對表型篩選后的腫瘤細胞進行如下候選基因的鑒定
a. 從存活下來的腫瘤內(nèi)提取基因組DNA;
b. PCR擴增從RNA干擾文庫中插入的DNA片段；
c. TA克隆法克隆PCR擴增的DNA片段；
d. 挑選克隆，純化DNA;
e. 基因測序確定篩選基因。 本發(fā)明對篩選基因?qū)δ[瘤轉(zhuǎn)移的影響作如下分析
a. 利用RNA干擾降低基因表達作Loss-of-function分析；
b. 利用過表達作Gain-of-function分析；
c. 利用生化實驗分析篩選基因影響腫瘤轉(zhuǎn)移的機制。 本發(fā)明對篩選基因在轉(zhuǎn)移腫瘤內(nèi)的狀態(tài)作如下分析
a.檢測篩選基因是否在轉(zhuǎn)移腫瘤細胞和樣品中突變；b. 檢測篩選基因是否在轉(zhuǎn)移腫瘤細胞和樣品中低表達；
c. 檢測篩選基因是否在轉(zhuǎn)移腫瘤細胞和樣品中被修飾，如甲基化等。 本發(fā)明的有益效果是從整個基因組水平篩選腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因，并用于
(1) 進一步研究腫瘤轉(zhuǎn)移的發(fā)生、發(fā)展及其作用機制；
(2) 發(fā)用此類基因作為腫瘤的生物標志，在診斷時，用于指導腫瘤治療方案的制定；在診 斷之后，用于評估治療效果和檢測復發(fā)；
(3) 用做腫瘤靶向治療的靶標，通過增強腫瘤轉(zhuǎn)移基因的功能達到防止、治療腫瘤轉(zhuǎn)移的 目的。
具體實施例方式
本發(fā)明的主要技術(shù)內(nèi)容是由于免疫缺陷小鼠細胞在體移植腫瘤轉(zhuǎn)移模型比細胞模型更
好地模擬腫瘤轉(zhuǎn)移發(fā)生，而RNA干擾文庫使得人類基因組的各種基因分別在腫瘤細胞株任意
地降低表達，使得其中腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因降低表達的細胞形成腫瘤轉(zhuǎn)移的潛能大大增強，這
樣，將RNA干擾文庫處理的細胞注入免疫缺陷小鼠體內(nèi)后，在對照細胞不能形成腫瘤轉(zhuǎn)移的 條件下，腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因降低表達的細胞可以形成肺腫瘤，通過分離肺腫瘤，并克隆肺腫 瘤內(nèi)的降低表達基因可以確定新的腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因。
本發(fā)明所具有的特征是
A、 與過去從離體細胞模型著手不同，從在體動物模型著手，更好地模擬了腫瘤轉(zhuǎn)移發(fā)
生的過程；
B、 利用降低基因表達的RNA干擾文庫，可以在哺乳細胞穩(wěn)定地低表達各種基因。
本發(fā)明采用如下技術(shù)路線
A、 表型篩選
a. 注入小量腫瘤細胞到免疫缺陷小鼠體內(nèi)后，對照和RNA文庫處理細胞都不形成肺腫 瘤；
b. 注入適量腫瘤細胞到免疫缺陷小鼠體內(nèi)后，對照細胞不形成肺腫瘤，而RNA文庫處 理細胞形成肺腫瘤；
c. 注入大量腫瘤細胞到免疫缺陷小鼠體內(nèi)后，對照和RNA文庫處理細胞都形成肺腫 瘤，兩者相比較，RNA文庫處理細胞形成更多肺腫瘤；
B、 候選基因鑒定a. 從存活下來的腫瘤內(nèi)提取基因組DNA;
b. PCR擴增從RNA干擾文庫中插入的DNA片段；
c. TA克隆法克隆PCR擴增的DNA片段；
d. 挑選克隆，純化DNA;
e. 基因測序確定篩選基因。
C、 分析篩選基因?qū)δ[瘤轉(zhuǎn)移的影響
a. 利用RNA干擾降低基因表達作Loss-of-function分析；
b. 利用過表達作Gain-of-function分析；
c. 利用生化實驗分析篩選基因影響腫瘤轉(zhuǎn)移的機制。
D、 分析篩選基因在轉(zhuǎn)移腫瘤內(nèi)的狀態(tài)
a. 檢測篩選基因是否在轉(zhuǎn)移腫瘤細胞和樣品中突變；
b. 檢測篩選基因是否在轉(zhuǎn)移腫瘤細胞和樣品中低表達；
c. 檢測篩選基因是否在轉(zhuǎn)移腫瘤細胞和樣品中被修飾，如甲基化等。 實施例1
免疫缺陷小鼠尾靜脈注射尤文氏肉瘤細胞TC71形成腫瘤肺轉(zhuǎn)移是一種穩(wěn)定、容易操 作、并被廣泛應(yīng)用的腫瘤轉(zhuǎn)移研究模型。結(jié)合利用本發(fā)明技術(shù)，我們己經(jīng)進行了尤文氏肉瘤 細胞的腫瘤肺轉(zhuǎn)移抑制基因篩選，分別篩選到了一批尤文氏肉瘤細胞的腫瘤肺轉(zhuǎn)移抑制基因
(另外申請產(chǎn)品專利)。以此為例介紹
具體實施例方式
一、利用RNA干擾文庫DNA轉(zhuǎn)染菲尼克思(Phoenix)反轉(zhuǎn)錄病毒包裝細胞 第一天準備菲尼克思反轉(zhuǎn)錄病毒包裝細胞
1、 轉(zhuǎn)染之前18-24小時，按3xl07l0厘米平板接種菲尼克思細胞到平板上；
2、 讓細胞貼壁10-24小時；
3、 當細胞密度達到2/3時， 一個10厘米平板大約有5xl(T細胞。這時的包裝細胞最容 易轉(zhuǎn)染并產(chǎn)生最高滴度的病毒37°C。
*培養(yǎng)基DMEM， 10%胎牛血清，1%青_鏈霉素，1%谷氨酰胺。 第二天轉(zhuǎn)染
1、準備好轉(zhuǎn)染用的DNA并溶解在HEPES溶液中；2、 轉(zhuǎn)染之前大約5分鐘，在平板中加入25微摩氯喹(氯喹的儲藏濃度為50毫摩)； *氯喹通過中和胞內(nèi)轉(zhuǎn)運微泡內(nèi)的pH而抑制溶酶體內(nèi)的DNA酶；
3、 在一個15毫升的試管內(nèi)，加入(以10厘米平板為例、室溫條件) 20微克文庫DNA和20微克輔助質(zhì)粒DNA; 62.5微升2摩爾的氯化鈣(手指輕彈混勻)；
加無菌雙蒸水至500微升總體積。
4、 快速加入500微升2倍的HEPES緩沖液，然后利用全自動移液槍激烈吹氣泡5-15
秒；
5、 轉(zhuǎn)染之前大約5分鐘，給包裝細胞換已預熱至、含終濃度25微摩氯喹的培養(yǎng)液9毫
升；
6、 20分鐘之后，將HEPES/DNA混合液逐滴、快速加入平板。 注意
*在顯微鏡下觀察，應(yīng)該看到一些大小均一、分布均勻的細小黑色顆粒； *將平板放入37。C孵箱，前后左右輕輕轉(zhuǎn)動平板使DNA/CaP04顆粒均勻分布； * HEPES購于Sigma (商品目錄號:H-7006) *氯化鈣購于Mallinkrodt (商品目錄號H-4160)
*由于pH非常重要，可分別配制pH 6.95、 pH 7.00、 pH 7. 05的緩沖液進行測試； *使用之前將所有的試劑復蘇到室溫。
第三天轉(zhuǎn)染后24小時，換液、準備好感染細胞TC71
1、 轉(zhuǎn)染后24小時，給包裝細胞換預熱至37°C的培養(yǎng)液10毫升(不要讓氯喹在培養(yǎng)液 中影響細胞超過24小時)；
2、 將感染靶細胞分盤，細胞密度為2xl06/10厘米平板，培養(yǎng)液DMEM， 10%胎牛血 清，1%青-鏈霉素，1%谷氨酰胺。
第四天轉(zhuǎn)染后24小時，用含反轉(zhuǎn)錄病毒的上清感染耙細胞TC71
1、 用移液槍從轉(zhuǎn)染后的包裝細胞中吸取上清并置于15毫升的試管內(nèi)，1500轉(zhuǎn)/分鐘離 心5分鐘以除去細胞碎片；
2、 用0.45微米濾膜過濾；3、 從靶細胞培養(yǎng)板內(nèi)吸除2毫升培養(yǎng)液；
4、 在靶細胞培養(yǎng)板內(nèi)加入5微升polybrene (polybrene的1000倍儲藏濃度為5毫克/ 毫升)，混勻；
5、 在靶細胞培養(yǎng)板內(nèi)加入2毫升含反轉(zhuǎn)錄病毒的上清，置于32-37°C，輕輕混勻；
6、 每隔4-6小時進行重復感染。
第五天吸除含反轉(zhuǎn)錄病毒的上清感染后24小時吸除含反轉(zhuǎn)錄病毒的上清，加入新 鮮的培養(yǎng)基DMEM， 10%胎牛血清，1%青-鏈霉素，1%谷氨酰胺。并加入5微升puromycin (puromycin的1000倍儲藏濃度為5毫克/毫升)篩選24小時。
二、 處理(表型篩選)
第六天感染后48小時(puromycin作用24小時)，靶細胞TC71可用于各種處理，進 行表型篩選。
1、 用胰酶消化收集感染靶細胞，并作成濃度不同的PBS懸液；
2、 選擇6周齡大小SCID小鼠30只，分成三組，按0. 25、 0. 5、 lxl07200nl/只濃度分 別進行尾靜脈注射RNA干擾文庫處理細胞和對照細胞。
三、 挑肺腫瘤
6周后，利用C02殺死實驗用鼠，打開胸腔取出肺臟，拍照后挑取腫瘤塊。
四、 基因鑒定
1、 剪碎腫瘤塊，利用Roche生產(chǎn)的High Pure PCR Template Preparation試劑盒(商 品目錄號11796828001)從收集的腫瘤樣品中提取基因組DNA;
2、 以基因組DNA為模板，通過PCR擴增插入細胞基因組DNA的RNA干擾文庫特異片段
(1) 擴增引物
RNAi clone 1: 5， -gag ggc eta ttt ccc atg at-3， (20bp)
RNAi clone 2: 5， -gta ata cga etc act ata ggg cct ctt egg aga tea get tc-3， (41bp)
(2) PCR反應(yīng)體系
H20 13. 0 pi
10xPCR Buffer 2. 5 pi25mM MgCl2 2. 0
2. 5mM dNTP 2. 0 pi
lOpM primer F2. 0 pi
10|aM Primer R 2. 0 |al
Taq 0. 5 pi
Template 1. 0 jul
Total 25. 0 pi
(3) PCR反應(yīng)條件
1. 94。C 3:00
2. 94°C 0:15
3. 60°C 0:45
4. 72。C 2:00
5. Go to 2 35X
6. 72°C 4:00
7. 40C forever
(4) PCR反應(yīng)結(jié)果在0.8%瓊脂糖凝膠水平電泳，觀察一0.6kb條帶。
3、 利用Irwitrogen Life Technologies生產(chǎn)的T0P0 TA克隆試劑盒(商品目錄號-K4600-01)將PCR擴增的插入細胞基因組DNA的RNA千擾文庫特異片段克??；
4、 挑選得到的克隆，置于含2毫升青霉素抗性的LB內(nèi)，37T振蕩培養(yǎng)16小時；
用Sigma-Aldrich生產(chǎn)的G匿Elute Plasmid Minipr印試劑盒(商品目錄號:PLN350)提 取質(zhì)粒；
5、 將質(zhì)粒送測序公司測序，測序引物為反向M13;
6、 利用公用的NCBI Blast程序(http:〃blast. ncbi. nlm. nih. gov/Blast. cgi)確定 基因；
對候選基因作生物信息學分析，了解基因的基本情況及其已知的功能。
12種腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因被鑒定出來。
五、腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因影響腫瘤轉(zhuǎn)移的鑒定
1、分別構(gòu)建腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因的基于反轉(zhuǎn)錄病毒載體的RNA干擾和過表達質(zhì)粒；2、 利用RNA文庫同樣的技術(shù)和步驟分別建立穩(wěn)定的RNA干擾和過表達腫瘤細胞；
3、 檢測各細胞的腫瘤轉(zhuǎn)移能力
(1) 免疫缺陷小鼠細胞在體移植腫瘤轉(zhuǎn)移模型檢測
選擇6周齡大小SCID小鼠20只，分成兩組，按0. 5xl07200)al/只濃度分別進行尾靜脈 注射穩(wěn)定的RNA干擾腫瘤細胞和對照細胞，6周后，利用C02殺死實驗用鼠，打開胸腔取出 肺臟，拍照、記數(shù)腫瘤數(shù)量和腫瘤塊大小。實驗組有更多的肺腫瘤形成，形成的腫瘤塊體積 更大；
選擇6周齡大小SCID小鼠20只，分成兩組，按1. Oxl07200nl/只濃度分別進行尾靜脈 注射穩(wěn)定的過表達腫瘤細胞和對照細胞，6周后，利用C02殺死實驗用鼠，打開胸腔取出肺 臟，拍照、記數(shù)腫瘤數(shù)量和腫瘤塊大小。實驗組有更少的肺腫瘤形成，形成的腫瘤塊體積更 小。
(2) 正常小鼠細胞在體移植腫瘤轉(zhuǎn)移模型檢測
由于免疫缺陷小鼠細胞在體移植腫瘤轉(zhuǎn)移模型不能模擬從腫瘤組織遷移出去這一起始步 驟，經(jīng)免疫缺陷小鼠細胞在體移植腫瘤轉(zhuǎn)移模型證實后，我們繼續(xù)進行更嚴格的檢測，即利 用正常健康小鼠，進行足底注射，然后觀測自發(fā)腫瘤轉(zhuǎn)移的發(fā)生。
選擇6周齡大小C57BL/6小鼠20只，分成兩組，按1. Oxl07200pl/只濃度分別進行足 底皮下注射穩(wěn)定的RNA干擾腫瘤細胞和對照細胞，當腫瘤塊達到100 mm3時，割除腫瘤塊，4 周后利用C02殺死實驗用鼠，打開胸腔取出肺臟，拍照、記數(shù)腫瘤數(shù)量和腫瘤塊大小。實驗 組有更多的肺腫瘤形成，形成的腫瘤塊體積更大；
選擇6周齡大小C57BL/6小鼠20只，分成兩組，按2. 0xl07200(al/只濃度分別進行足 底皮下注射穩(wěn)定的過表達腫瘤細胞和對照細胞，當腫瘤塊達到100 mm3時，割除腫瘤塊，4 周后利用C02殺死實驗用鼠，打開胸腔取出肺臟，拍照、記數(shù)腫瘤數(shù)量和腫瘤塊大小。實驗 組有更少的肺腫瘤形成，形成的腫瘤塊體積更小。
六、實驗材料和儀器
1、 各種實驗室常規(guī)儀器；
2、 細胞培養(yǎng)箱(Forma Scientific, Inc.,美國);
3、 超凈工作臺(Forma Scientific, Inc.,美國)；
4、 分光光度計(BIO-TEK INSTRUMENTS, Inc.,美國)；5、 Z1-顆粒計數(shù)器(BECKMAN COULTER,美國)；
6、 倒置顯微鏡(尼康，日本)；
7、 解剖顯微鏡(尼康，日本)；
8、 PCR儀(Bio-Rad，美國)。
權(quán)利要求
1、一種利用RNA干擾文庫篩選腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因的方法，該方法是利用免疫缺陷小鼠細胞在體移植腫瘤轉(zhuǎn)移模型比細胞模型更好地模擬腫瘤轉(zhuǎn)移發(fā)生，利用RNA干擾文庫使得人類基因組的各種基因分別在腫瘤細胞株任意地降低表達，使得其中腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因降低表達的細胞形成腫瘤轉(zhuǎn)移的潛能大大增強，這樣，將RNA干擾文庫處理的細胞注入免疫缺陷小鼠體內(nèi)后，在對照細胞不能形成腫瘤轉(zhuǎn)移的條件下，腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因降低表達的細胞可以形成肺腫瘤，通過分離肺腫瘤，并克隆肺腫瘤內(nèi)的降低表達基因可以確定并篩選新的腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用RNA干擾文庫篩選腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因的方法，其特征在 于所述的腫瘤細胞進行如下表型篩選-a. 注入小量腫瘤細胞到免疫缺陷小鼠體內(nèi)后時，對照和RNA文庫處理細胞都不形成肺腫 瘤；b. 注入適量腫瘤細胞到免疫缺陷小鼠體內(nèi)后時，對照細胞不形成肺腫瘤，而RNA文庫處 理細胞形成肺腫瘤；c. 注入大量腫瘤細胞到免疫缺陷小鼠體內(nèi)后時，對照和RNA文庫處理細胞都形成肺腫 瘤，兩者相比較，RNA文庫處理細胞形成更多肺腫瘤；
3、 根據(jù)權(quán)利要求2所述的利用RNA干擾文庫篩選腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因的方法，其特征在 于所述的對表型篩選后的腫瘤細胞進行如下候選基因的鑒定a. 從存活下來的腫瘤內(nèi)提取基因組DNA;b. PCR擴增從RNA干擾文庫中插入的DNA片段；c. TA克隆法克隆PCR擴增的DNA片段；d. 挑選克隆，純化DNA;e. 基因測序確定篩選基因。
4、 根據(jù)權(quán)利要求3所述的利用RNA干擾文庫篩選腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因的方法，其特征在 于所述的對篩選基因?qū)δ[瘤轉(zhuǎn)移的影響作如下分析a. 利用RNA干擾降低基因表達作Loss-of-function分析；b. 利用過表達作Gain-of-function分析；c. 利用生化實驗分析篩選基因影響腫瘤轉(zhuǎn)移的機制。
5、根據(jù)權(quán)利要求3所述的利用RNA干擾文庫篩選腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因的方法，其特征在 于所述的對篩選基因在轉(zhuǎn)移腫瘤內(nèi)的狀態(tài)作如下分析a. 檢測篩選基因是否在轉(zhuǎn)移腫瘤細胞和樣品中突變；b. 檢測篩選基因是否在轉(zhuǎn)移腫瘤細胞和樣品中低表達；c. 檢測篩選基因是否在轉(zhuǎn)移腫瘤細胞和樣品中被修飾，如甲基化等。
全文摘要
一種利用RNA干擾文庫篩選腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因的方法，它是利用免疫缺陷小鼠細胞在體移植腫瘤轉(zhuǎn)移模型比細胞模型更好地模擬腫瘤轉(zhuǎn)移發(fā)生，利用RNA干擾文庫使得人類基因組的各種基因分別在腫瘤細胞株任意地降低表達，使得其中腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因降低表達的細胞形成腫瘤轉(zhuǎn)移的潛能大大增強，這樣，將RNA干擾文庫處理的細胞注入免疫缺陷小鼠體內(nèi)后，在對照細胞不能形成腫瘤轉(zhuǎn)移的條件下，腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因降低表達的細胞可以形成肺腫瘤，通過分離肺腫瘤，并克隆肺腫瘤內(nèi)的降低表達基因可以確定并篩選新的腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因；本發(fā)明從整個基因組水平篩選腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因，并用于(1)進一步研究腫瘤轉(zhuǎn)移的發(fā)生、發(fā)展及其作用機制；(2)發(fā)用此類基因作為腫瘤的生物標志，在診斷時，用于指導腫瘤治療方案的制定；在診斷之后，用于評估治療效果和檢測復發(fā)；(3)用做腫瘤靶向治療的靶標，通過增強腫瘤轉(zhuǎn)移基因的功能達到防止、治療腫瘤的轉(zhuǎn)移的目的。
文檔編號A61K49/00GK101455848SQ20091009526
公開日2009年6月17日 申請日期2009年1月5日 優(yōu)先權(quán)日2009年1月5日
發(fā)明者羅如意, 黃行許 申請人:黃行許;宋建華