專利名稱：粘膜疫苗的制作方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明涉及一種有效誘導粘膜免疫IgA和血中免疫IgG的粘膜疫苗。
背景技術(shù)：
在專利文獻I及2中，詳細記載了與現(xiàn)有的鈍化疫苗及類毒素等中的缺點、粘膜疫苗及免疫佐劑的開發(fā)有關的現(xiàn)狀等。
如這些專利文獻1、2中記載所述，廣泛且深刻地認識到用在作為病毒的自然感染途徑的粘膜中誘導IgA抗體產(chǎn)生的粘膜疫苗來代替向皮下、肌肉內(nèi)等接種的現(xiàn)有疫苗的必要性。特別是作為21世紀的下一代疫苗，全世界均期待誘導IgA抗體的產(chǎn)生、局部免疫或粘膜免疫的所謂粘膜疫苗的開發(fā)和實用化，但尚未實現(xiàn)。本申請發(fā)明人等對于這樣的課題，發(fā)明了由作為肺表面活性蛋白質(zhì)B及/或肺表面活性蛋白質(zhì)C與脂質(zhì)的復合體的抗原藥物(AD)載體(vehicle)和由該AD載體和抗原構(gòu)成的粘膜疫苗，并提出了專利申請(專利文獻I)。進而，本申請發(fā)明人等發(fā)現(xiàn)通過調(diào)節(jié)AD載體量(V)和抗原量㈧的重量比V/A，可以轉(zhuǎn)換IgA抗體的選擇性產(chǎn)生和IgA · IgG兩抗體產(chǎn)生，并提出了以此為作用機制的粘膜疫苗的專利申請(專利文獻2)。另外，專利文獻1、2也公開了肺表面活性蛋白質(zhì)B及C的片段(肽)的有效性。進而，本申請發(fā)明人等對肺表面活性蛋白質(zhì)片段的各種變異體研究了抗體產(chǎn)生增強作用，結(jié)果發(fā)明了以合成肽KnLm(其中，η為4_8，m為11-20)為成分的AD載體和包含該AD載體和抗原的粘膜疫苗并提出了專利申請(專利文獻3)，所述合成肽雖然為比專利文獻1、2所公開的部分肽小的肽，但具有抗體產(chǎn)生的強誘導或者增強作用，特別是具有分泌型IgA抗體的單獨產(chǎn)生、以及分泌型IgA和血中IgG兩種抗體產(chǎn)生的優(yōu)異且有效的誘導作用。另外，對采用與粘膜疫苗相同的給藥經(jīng)路的滴鼻劑而言，為了提高其粘度并持續(xù)發(fā)揮對于花粉癥或過敏的效能，廣泛使用有羧基乙烯基聚合物(CVP) (Carboxyvinylpolymer)或羥丙基纖維素(HPC)，另外，使用有以海藻酸鈉為代表的增稠凝膠化劑。例如也已知有含有HPC的粘膜疫苗(專利文獻4)及含有CVP的粘膜應用型疫苗制劑(專利文獻
5)及鼻腔內(nèi)噴霧給藥用流感疫苗(專利文獻6)等。另外，在專利文獻7中公開有一種由抗原、佐劑[特別是Poly (1.C.)]及增稠劑(海藻酸鈉等)構(gòu)成的粘膜給藥用的疫苗。專利文獻1:國際公開W02005/097182號公報專利文獻2 :國際公開W02007/018152號公報專利文獻3 :國際公開W02009/123119號公報專利文獻4 :日本特開2008-231343號公報專利文獻5 :國際公開W001/017556號公報專利文獻6 :日本特開平03-38529號公報專利文獻7 :日本特開2009-209086號公報
發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明要解決的課題專利文獻3的粘膜疫苗具有強抗體產(chǎn)生能力，但作為粘膜疫苗的共通的問題點，具有需要比經(jīng)皮注射疫苗更多的抗原。為了進行有效的疫苗治療，相對于作為其目標的傳染病的流行范圍，需要充分量的疫苗，在鑒于現(xiàn)狀的抗原生產(chǎn)量規(guī)模的情況下，粘膜疫苗增產(chǎn)很困難。因此，要求對粘膜疫苗賦予更強的抗體產(chǎn)生能力。本申請發(fā)明的課題在于提供一種改良型粘膜疫苗，所述改良型粘膜疫苗與專利文獻3中記載的粘膜疫苗相比具有更強的抗體產(chǎn)生能力，作為其結(jié)果，能夠以與經(jīng)皮注射疫苗相匹敵那樣的少量的抗原發(fā)揮優(yōu)異的效果。用于解決課題的手段作為進一步增強專利文獻3的粘膜疫苗的抗體誘導的方法，本申請發(fā)明人等從滴 鼻劑或粘膜應用型疫苗中使用的凝膠化劑(CVP、HPC)中，試驗了作用于AD載體，增加運送至抗原呈遞細胞的抗原量并對粘膜免疫IgA及血中免疫IgG的誘導效果，確認了以下內(nèi)容。(I)與專利文獻3的粘膜疫苗(抗原+合成肽+脂質(zhì))或?qū)＠墨I5、6的粘膜疫苗(抗原+CVP)相比，由包含“抗原+合成肽+脂質(zhì)+CVP”的粘膜疫苗具有特別優(yōu)異的抗體誘導能力，其效果大大超過由專利文獻3 (抗原+合成肽+脂質(zhì))和專利文獻5、6 (抗原+CVP)的簡單的組合所預測的范圍。(2)與CVP同樣地作為滴鼻劑或粘膜疫苗的凝膠化劑被廣泛報告的HPC賦形劑在與抗原并用或者與抗原并用于AD載體的情況下，完全不具有抗體誘導能力，也無法期待誘導粘膜免疫IgA及血中免疫IgG的效果。(3)即使將抗原量減少至專利文獻3的粘膜疫苗(抗原+合成肽+脂質(zhì))的需要量的約1/5以下，“抗原+合成肽+脂質(zhì)+CVP”的粘膜疫苗仍然具有特別強的抗體誘導效果。本發(fā)明是基于以上的新見解而完成的。S卩，本發(fā)明為一種粘膜疫苗，其特征在于，含有以下的組成(a)包含合成肽和脂質(zhì)的AD載體，所述合成肽包含KnLm(其中，η為4_8，m為11-20)的氨基酸序列；(b)羧基乙烯基聚合物；及(C)抗原蛋白，所述抗原蛋白為單獨不會產(chǎn)生引起有效的感染防御效果的量的粘膜免疫IgA及血中免疫IgG的量，所述粘膜疫苗產(chǎn)生引起有效的感染防御效果的量的抗原特異性粘膜免疫IgA及血中免疫IgG。在本發(fā)明的粘膜疫苗中，其中，抗原蛋白(C)為即使進一步利用與AD載體(a)的組合或與羧基乙烯基聚合物(b)的組合也不會產(chǎn)生引起有效的感染防御效果的量的抗原特異性粘膜免疫IgA及血中免疫IgG的量。在該粘膜疫苗中的一形態(tài)中，所述合成肽為包含序列編號I或2的氨基酸序列的肽。另外，在該粘膜疫苗中的其它的方式中，脂質(zhì)為卵磷脂、二棕櫚酰磷脂酰膽堿、磷脂酰絲氨酸、磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇、磷脂酰乙醇胺、磷脂酸、月桂酸、肉豆蘧酸、棕櫚酸、硬脂酸及油酸中的至少一種。進一步具體而言，脂質(zhì)為二棕櫚酰磷脂酰膽堿、磷脂酰甘油及棕櫚酸的三種脂質(zhì)混合物。
在該粘膜疫苗中的又一方式中，抗原包括源自病原體的鈍化抗原、純化抗原、部分純化抗原、重組抗原或無毒化毒素、成為過敏原因的過敏原。進而，本發(fā)明為一種粘膜疫苗的制造方法，所述粘膜疫苗含有以下的組成(a)包含合成肽和脂質(zhì)的AD載體，所述合成肽包含KnLm(其中，η為4_8，m為11-20)的氨基酸序列；(b)羧基乙烯基聚合物；及(C)抗原蛋白，所述抗原蛋白為單獨不會產(chǎn)生引起有效的免疫誘導的量的粘膜免疫IgA及血中免疫IgG的量，所述粘膜疫苗產(chǎn)生引起有效的免疫誘導和感染防御效果的量的抗原特異性粘膜免疫IgA及血中免疫IgG， 所述方法的特征在于，(I)將所述(a)及(C)懸浮在水中，(2)將加溫和攪拌重復I次以上，(3)進行冷凍干燥，(4)將冷凍干燥體懸浮在生理鹽水中并制備成規(guī)定濃度，(5)加入所述(b)的溶液。在本發(fā)明中，所謂“引起有效的免疫誘導的量的粘膜免免疫IgA及血中免疫IgG”例如為血液的病毒感染抑制效果HI值為國際評價基準以上那樣的量的IgA及IgG。需要說明的是，在以下的說明中，有時將包含合成肽和脂質(zhì)的組合物記為“AD載體”，將包含該AD載體和所述抗原的組合物記為“粘膜疫苗”。這些“AD載體”及“粘膜疫苗”與專利文獻3中所公開的載體及疫苗的實施性相同。進而，有時將在該粘膜疫苗中添加了CVP的組合物記為“CVP添加粘膜疫苗”。另外，對本申請發(fā)明而言，關于所述的“脂質(zhì)”，含有專利文獻1-3的公開內(nèi)容，關于“合成肽”及“AD載體”，含有專利文獻3的公開內(nèi)容。發(fā)明效果本申請發(fā)明的CVP添加粘膜疫苗具有疫苗抗原特異性IgA及IgG抗體的極強的誘導效果和遠遠超過所誘導的抗體的國際基準的強病毒感染抑制效果(HI效果)。即使與專利文獻3中記載的粘膜疫苗或者“抗原+CVP疫苗”(專利文獻5、6)相比，這些效果也極其顯著，為無法由專利文獻3的粘膜疫苗效果和專利文獻5、6的CVP效果預測的優(yōu)良效果。由于這樣的強抗體誘導能力，可通過含有比現(xiàn)有的粘膜疫苗更少量的抗原來實現(xiàn)需要的感染防御效果。即，本申請發(fā)明的CVP添加粘膜疫苗即使將抗原量減少至現(xiàn)有的粘膜疫苗(抗原+合成肽+脂質(zhì))中使用的抗原量的1/5以下，也顯示特別強的抗體誘導效果。例如如試驗例2所示，專利文獻3的粘膜疫苗在將流感抗原用作抗原的情況下，即使抗原量為O. 2 μ g，血液的病毒感染抑制效果HI也未達到流感疫苗的國際評價基準即HI =40，但本發(fā)明的CVP添加粘膜疫苗中的抗原量即使為O.1 μ g，進而為O. 03 μ g，也顯示HI值為100以上這樣的優(yōu)異的病毒感染抑制效果。進而，本申請發(fā)明的CVP添加粘膜疫苗的組合物(AD載體、CVP)本身沒有抗原識別細胞刺激效果，因此，引起由給藥的疫苗抗原之外的抗原導致的意外的副作用，例如自體免疫性疾病、疫苗接種后的過敏惡化等的可能性極低。另外，根據(jù)本發(fā)明的粘膜疫苗制造方法，可以制造一種具有更高的抗原特異性粘膜免疫IgA及血中免疫IgG產(chǎn)生能力的粘膜疫苗。


圖1為試驗I的結(jié)果即將實施例1、比較例1-5的各疫苗、HA抗原分別對小鼠經(jīng)鼻給藥時的鼻清洗液IgA量(左)和血清IgG量(右)；圖2為試驗I的結(jié)果即將實施例1、比較例1、5的各疫苗、HA抗原及作為比較對象的HA+AD載體分別對小鼠經(jīng)鼻給藥時的抗流感病毒HA抗體所顯示的HI效價；圖3為在試驗2中，用內(nèi)毒素(LPS)、poly(1.C.)和SF-1O (CVP+AD載體)分別刺激抗原遞呈樹狀細胞并對細胞膜的活化表示分子(MHC I1、⑶40、⑶80(B7-1)及⑶86(B7_2))的表達水平進行測定的結(jié)果。左圖表示各膜分子的表達量增加而判定為陽性的細胞(超過右側(cè)的點圖表中由用作對照的生理鹽水處理而確定的中央附近的陰性值上限顯示條的值的細胞)的總細胞數(shù)中的比例(％)，右圖為利用流式細胞儀的測定結(jié)果對細胞膜上的活化 表示分子的量進行可視化定量的圖；圖4為試驗4的結(jié)果，表示感染的流感病毒PFU量和生存率的關系；圖5為試驗4的結(jié)果，表示對小鼠(各組10只)經(jīng)鼻給藥實施例1、實施例5、比較例5及比較例6的各疫苗后，感染50PFU的流感病毒時的生存率的變化；圖6為試驗4的結(jié)果，表示對小鼠(各組10只)經(jīng)鼻給藥實施例1、實施例5、比較例5及比較例6的各疫苗后，感染800PFU的流感病毒時的生存率的變化；圖7為表示試驗6結(jié)果的透射型電子顯微鏡照片。㈧為比較例I的粘膜疫苗，(B)為實施例1的CVP添加粘膜疫苗和其部分擴大圖(右圖)；圖8為在試驗7中，利用流式細胞儀對由樹狀細胞檢測的熒光標記抗原量進行測定的結(jié)果。將用單獨給藥HA抗原時在樹狀細胞中檢測的抗原熒光標記量設為I時，以各自的測定條件下促進熒光標記量的倍數(shù)作為縱軸，以“Fold versus HA” =[測定各樣品時的MFI]/[單獨添加HA的樹狀細胞的MFI]的形式進行表示。MF1:平均熒光強度** p< O. Olvs. HA(n = 3)；圖9為在試驗8中，用poly (1. C. )、SF-1O (CVP+AD載體)分別刺激抗原遞呈樹狀細胞并對細胞膜的活化表示分子(CD86)的表達水平進行測定的結(jié)果?！鯙闊oHA抗原蛋白，■為有HA抗原蛋白的結(jié)果。MF1:平均熒光強度，* p < O. 05vs.僅佐劑(Adjuvant alone)(η = 3)；圖10為在試驗9中，在抗原存在下及不存在下對小鼠經(jīng)鼻給藥SF-1O (CVP+AD載體)佐劑并對由鼻腔組織制備的樹狀細胞的CD86表達水平進行測定的結(jié)果。MF1:平均熒光強度。
具體實施例方式本申請發(fā)明的CVP添加粘膜疫苗包含以下的組成。合成肽是包含KnLm(其中，η為4_8，m為11-20)的氨基酸序列的合成肽。對該KnLm而言，N端側(cè)的η個K(Lys)殘基和C端側(cè)的m個L殘基連接。這樣的合成肽為例如以下的任一種肽。需要說明的是，括弧內(nèi)為肽的簡稱。另外，氨基酸殘基由一個文字符號表示。
序列編號I (K6L 16) KKKKKKLLLLLLLLLLLLLLLL序列編號2 (K6L11) KKKKKKLLLLLLLLLLL序列編號I (K6L16)由N端側(cè)的6個K(Lys)殘基和C端側(cè)的16個L殘基構(gòu)成,序列編號2(K6L11)由N端側(cè)的6個K(Lys)殘基和C端側(cè)的11個L殘基構(gòu)成。這些合成肽使用依據(jù)公知的化學合成法所制備的純度95%以上的材料。MM作為磷脂質(zhì)，優(yōu)選使用肺表面活性物質(zhì)含有的磷脂質(zhì)，例如卵磷脂、二棕櫚酰磷脂酰膽堿、磷脂酰絲氨酸、磷脂酰甘油等。另外，可以使用磷脂酰肌醇、磷脂酰乙醇胺、磷脂酸及鞘磷脂等。另外，作為脂肪酸，可以使用月桂酸、肉豆蘧酸、棕櫚酸、硬脂酸、棕櫚油酸及油酸等。進而可以使用源自肺的膨脹活躍的鯨、海豚等水生動物的脂質(zhì)。 羧某乙烯某聚合物(CVP)
CVP為以丙烯酸作為主要成分進行聚合而得到的親水性聚合物，可以使用HIVISffAKO 103, HIVISffAKO 104, HIVISffAKO 105、Sigma 公司制 pAA130 (Sigma, St. Louis,MO, CatNo. 181293)、pAA450 (Sigma, CatNo. 181285)、pAA1250 (Sigma, CatNo. 306215)等市售品。其中，優(yōu)選化妝品及醫(yī)藥品用凝膠的制作中所通用的HIVISWAKO 104、Sigma公司制pAA130、pAA1250?？梢杂眉兯蛘呱睇}水在超聲波處理下將CVP制作0. 2-2. O重量％溶解液后，用NaOH中和液進行pH 5. 0-10. 5的制作，但優(yōu)選選擇不會影響疫苗抗原的穩(wěn)定性的pH。例如在流感裂解疫苗抗原的情況下，pH被調(diào)節(jié)為6. 8-8. 0，優(yōu)選pH為7. 0-7. 2。技厘抗原含有用于疫苗的經(jīng)高度純化的純度為約90%以上的源自細菌的抗原、病毒抗原、類毒素等蛋白質(zhì)、糖蛋白質(zhì)、過敏原、高分子糖質(zhì)及核酸等抗原分子。例如為水痘病毒、麻疹病毒、流行性腮腺炎病毒、脊髓灰質(zhì)炎病毒、輪狀病毒、流感病毒、腺病毒、皰疹病毒、嚴重急性呼吸綜合征(SARS)病毒、西尼羅病毒、漢坦病毒、登革病毒、日本腦炎病毒、黃熱病毒、蜱傳腦炎病毒、HIV病毒、C型肝炎病毒、百日咳菌、腦膜炎菌、流感b型菌、肺炎菌、霍亂弧菌、瘧疾病原體、昏睡病病原體等的疫苗用的抗原。這些抗原制備即使其單獨、特別是與AD載體(a)或與羧基乙烯基聚合物(CVP)組合也不會產(chǎn)生引起有效的免疫誘導的量的抗原特異性粘膜免疫IgA及血中免疫IgG的量進行使用。另外，在流感抗原蛋白的情況下，除HA抗原分子以外，含有M蛋白、神經(jīng)氨酸酶及核蛋白等。在以下的說明中，抗原蛋白量是指含有這些抗原分子的蛋白質(zhì)總量。對使用的批量流感疫苗而言，HA抗原分子自身的量為抗原總蛋白量的約50 %。接著，對由這些材料制備AD載體及CVP添加粘膜疫苗的方法進行說明。AD載體的制備以任意比例混合上述脂質(zhì)中的幾種，作為脂質(zhì)量，例如以成為10mg/mL的濃度的方式懸浮于氯仿甲醇(2 : l(v/v))混合液，作為脂質(zhì)成分。另外，合成肽以濃度為例如5. 0mg/mL的方式溶解于乙醇。接著，混合該脂質(zhì)成分和合成肽。對混合比而言，合成肽為約0. 2 約12. O干燥重量％，脂質(zhì)為約88 約99. 8干燥重量％。使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器將該混合物在約40°C下進行干固，以任意濃度再懸浮于10%乙醇，在約45°C的水浴中振蕩混合15分鐘左右，制備均勻分散液并冷凍干燥。將該干燥物在約_30°C下保存，每次在使用時加入純水或生理鹽水使其懸浮后，使用超聲波、均化器、混合器、振蕩儀等制成均勻分散液。CVP添加粘膜疫苗的制備以任意比例混合上述AD載體、CVP及抗原。即，在流感疫苗的情況下，以使AD載體量(V)相對于疫苗中的抗原蛋白量(A)的干燥重量比V/A為期望的值的方式在疫苗原液中添加混合AD載體液進行制備。對每只小鼠給藥的抗原蛋白的干燥重量(A)為約0.01 約10 μ g/kg體重，優(yōu)選為約O. 03 約5. O μ g/Kg體重。該抗原量為專利文獻3的粘膜疫苗(抗原+AD載體)中的抗原量(約O.1 50 μ g/kg體重，優(yōu)選為約O. 3 30 μ g/Kg體重)的1/5以下。在這樣的抗原量中，用于優(yōu)先且選擇性地誘導IgA抗體產(chǎn)生的V/A優(yōu)選為約O.1 約1. O。另外，用于誘導IgA及IgG兩種抗體產(chǎn)生的V/A為約1. O 約100，優(yōu)選采用約5 約20的范圍。在如上所述的V/A中，抗原的約60%以上與AD載體結(jié)合，由此得到的粘膜免疫疫苗可有效地誘導IgA抗體產(chǎn)生及/或IgG抗體產(chǎn)生。另外，加入了 CVP的最終經(jīng)鼻給藥疫苗液中的CVP濃度為約O. 1% 1. 0%，優(yōu)選以O. 3 % O. 8 %的比例添加。另外，為了均勻地混合AD載體、抗原及CVP，可以使用均化器、混合器、振蕩儀及攪拌器等。具體而言，如下述實施例1所示，可以如下制備CVP添加粘膜疫苗在混合抗原蛋白和AD載體后，進行3分鐘超聲波處理，進一步在室溫下旋轉(zhuǎn)混合2小時后，最后加入等量的I % CVP生理鹽水溶液。除了添加CVP之外，該方法與專利文獻3中記載的方法相同。但是，該方法存在如下不良情況有時由于超聲波處理產(chǎn)生的發(fā)熱使病毒抗原失活；有時由于使用機器和材料的種類、振蕩器的大小、振蕩器的狀態(tài)等，超聲波處理行程難以保持一定的條件。因此，優(yōu)選由實施例7所示那樣的以下工序構(gòu)成的制造方法。(I)將AD載體和抗原蛋白懸浮在水(純水)中(2)將加溫和攪拌重復I次以上(3)冷凍干燥(4)將冷凍干燥體懸浮在生理鹽水中并制備成規(guī)定濃度(5)添加溶解在生理鹽水中的CVP溶液該方法不僅解決了由超聲波處理引起的上述問題點，而且如后述試驗5中所示那樣可以更高地產(chǎn)生抗原特異性的IgA及IgG，是優(yōu)異的方法。制備的CVP添加粘膜疫苗也可以以一次給藥使用，但優(yōu)選以二次給藥(初次免疫和二次免疫)或三次給藥(初次免疫、二次免疫、三次免疫)的形式使用。通過這樣的多次免疫處置，可以顯著地增加IgA及IgG的抗體效價。另外，二次或三次疫苗給藥以I周 3周，優(yōu)選以約2周的間隔進行。進而，本申請發(fā)明的CVP添加粘膜疫苗的給藥路徑除鼻腔之夕卜，也可以對口腔內(nèi)或陰道給藥(例如Lubrizol Pharmaceutical Bulletin,Polymers forPharmaceutical Applications, Lubrizol Advanced Materials, Inc.2008)。以下，示出實施例對本申請發(fā)明進行更詳細且具體的說明，但本申請發(fā)明并不限定于以下的例子。實施例1[包含超聲波處理的制造工序]
首先，如下制備AD載體。以75 : 25 : 10 (w/w/w)的比例混合二棕櫚酰磷脂酰膽堿(DPPC)、磷脂酰甘油(PG)及棕櫚酸(PA)，以磷脂質(zhì)量計為10mg/ml的濃度的方式懸濁于氯仿甲醇(2 : l(v/v))混合液，作為脂質(zhì)成分。另外，將純度95%以上的合成肽K6L16 (KKKKKKLLLLLLLLLLLLLLLL) (GenScript 公司制)以成為 5. Omg/mL 的方式溶解在甲醇中。以重量比計磷脂質(zhì)成分K6L16= 100 2的方式混合脂質(zhì)成分(DPPC PG PA =75 : 25 : 10，w/w/w)溶液和K6L16肽溶液，使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器在40°C下進行干固。將其以磷脂質(zhì)量計為4mg/mL的方式再懸浮于10%乙醇，在45°C的水浴中振蕩混合15分鐘，制備均勻分散液。對其進行冷凍干燥并作為AD載體在_30°C下進行保存。接著，使用上述AD載體如下制備CVP添加粘膜疫苗。冷凍干燥后的AD載體必須懸浮在生理鹽水中使用。流感疫苗(HA)抗原使用由 阪大微生物病研究會提供的A/NewCaledonia/20/99 (HlNl)、1. 94mg蛋白質(zhì)/mL(磷酸鈉緩沖液、氯化鈉、乙基汞硫代水楊酸鈉溶液=ImL中溶解磷酸氫鈉水合物3. 53mg、磷酸二氫鈉O. 54mg、氯化鈉8. 50mg及乙基汞硫代水楊酸鈉O. 008mg)。對疫苗和AD載體的混合量而言，以AD載體溶液的磷脂質(zhì)量(V)相對于抗原溶液的蛋白量㈧的量比V/A = 10的方式進行混合，以30秒的間隔對超聲波處理重復三次開啟關閉，進行由合計90秒的開啟和90秒的關閉構(gòu)成的合計3分鐘的超聲波處理(model S_250D、Branson Ultrasonics Danbury),進一步在室溫下旋轉(zhuǎn)混合2小時后，溶解在生理鹽水中，以最終濃度為O. 5%的方式加入調(diào)節(jié)成中性的I % CVP (HIVISWAKO 104)。即，對每只小鼠單鼻孔給藥2 μ L進行兩鼻孔給藥合計4 μ L，該4 μ L中所含組成為流感疫苗(HA)抗原蛋白量/AD載體溶液的磷脂質(zhì)量/CVP重量=0. 2 μ g/2. O μ g/20 μ go另夕卜，該CVP添加粘膜疫苗的pH設為維持HA抗原蛋白的抗原性的范圍(7. 0-7. 2)。以下，將該CVP添加粘膜疫苗記為“HA+SF-10”。另外，如上所述，SF-10量為AD載體(2. Oyg)+CVPQOyg) = 22 μ g，但在下述說明中，用作為佐劑的載體作用的基本骨架的AD載體的磷脂質(zhì)量進行表記，記為SF-10(2. 0μ g)。其它的實施例中的SF-10量也用除CVP量以外的值進行記載。實施例2根據(jù)實施例1的方法制備HA抗原蛋白量為0.1 μ g的CVP添加粘膜疫苗。HA抗原蛋白、AD載體及CVP的混合比與實施例1相同(即，含有抗原蛋白量10倍的AD載體和最終濃度0.5%的CVP)。實施例3根據(jù)實施例1的方法制備HA抗原蛋白量為0. 03 μ g的CVP添加粘膜疫苗。HA抗原蛋白、AD載體及CVP的混合比與實施例1相同(即含有抗原蛋白量10倍的AD載體和最終濃度0.5%的CVP)。比較例I制備專利文獻3的粘膜疫苗(HA+AD載體)。HA抗原蛋白及AD載體使用與實施例1相同的物質(zhì)，根據(jù)實施例1制備疫苗。HA抗原蛋白量為0.2 μ g，AD載體量為2.0. μ g。比較例2
制備專利文獻5、6中所公開的粘膜疫苗(HA+CVP)。HA抗原蛋白及CVP使用與實施例I相同的物質(zhì)，根據(jù)實施例1制備疫苗。HA抗原蛋白量為O. 2 μ g，CVP為最終濃度O. 5 %。比較例3制備專利文獻4中所公開的粘膜疫苗(HA+HPC)。HA抗原蛋白使用與實施例1相同的物質(zhì)，HPC使用市售的HPC 6. 0-10. O (和光純藥)。根據(jù)實施例1制備疫苗。HA抗原蛋白量為O. 2 μ g，HPC量為20 μ g。比較例4·制備在專利文獻3的HA+AD載體中進一步添加了 HPC的粘膜疫苗(HA+AD載體+HPC)。HA+AD載體使用與比較例I相同的物質(zhì)，HPC使用與比較例3相同的物質(zhì)，根據(jù)實施例I制備疫苗。HA抗原蛋白量為O. 2 μ g，AD載體量為2. O μ g，HPC量為20 μ g。比較例5根據(jù)文獻((Asah1-OzakiY et al. , Microbes Infect 2006;8:2706-2714，Ichinohe T，et al.，J Virol 2005 ；79(5) :2910-2919)中記載的方法制備含有樹狀細胞的Toll樣受體(TLR)的配合基、即強烈刺激抗原呈遞細胞而促進抗體產(chǎn)生的poly(1.C.)(Alexis Corp)的粘膜疫苗(HA+poly (1. C.))。HA 抗原蛋白量為 0. 2 μ g，poly (1. C.)量為2 μ g0比較例6用生理鹽水稀釋HA抗原并將其用作疫苗。每只的HA抗原蛋白給藥量為0. 2 μ g。[試驗I]使用小鼠，對經(jīng)鼻粘膜疫苗的抗體產(chǎn)生增強作用進行試驗。1.粘膜疫苗· HA+SF-10 (實施例1)· HA+AD載體(比較例I)· HA+CVP (比較例 2)· HA+HPC (比較例 3)· HA+AD 載體 +HPC (比較例 4)· HA+poly (1. C.)(比較例 5)· HA單獨(比較例6)2.動物從日本SLC株式會社(日本靜岡)購入6-8周齡的雌BALB/c雌小鼠后使用。全部的動物實驗由德島大學醫(yī)學部實驗動物中心的感染動物舍(P2水平)進行，按照德島大學醫(yī)學部動物實驗委員會的操作規(guī)則來進行。3.免疫法在疫苗的經(jīng)鼻給藥中，將上述I的5種粘膜疫苗以單鼻孔2μ L進行兩側(cè)給藥，將合計4μ L的疫苗向用氯胺酮(62. 6mg/Kg)及甲苯噻嗪(12. 4mg/Kg)麻醉的小鼠的兩側(cè)鼻腔點鼻給藥。對照使用與疫苗液等量的生理鹽水給藥組及比較例6 (HA抗原蛋白單獨給藥組)。各組由9_10只小鼠構(gòu)成。免疫對于初次免疫后第二周的由同樣的組成構(gòu)成的樣品，對各組作為2次免疫進行等量經(jīng)鼻給藥。在二次免疫后在第二周通過同樣的方法進行三次免疫，然后，在第二周采集樣品。另外，疫苗給藥合計進行三次，但即使以二次免疫結(jié)束也可得到基本相同的結(jié)果。4.小鼠鼻腔·肺泡清洗液及血清的制備制備三次免疫后第二周的小鼠的鼻腔·肺泡清洗液及血清并對病毒HA抗原特異性的 IgA、IgG進行測定。根據(jù)文獻(Mizuno D, Ide-Kurihara M, Ichinomiya T,Kubo I,KidoH. Modified pulmonary surfactant is a potentadjuvant that stimulates the mucosalIgA production in response to the influenza virus antigen. J Tmmunol.2006 ； 176 1122-30)記載的方法如下進行。在戊巴比妥麻醉下對疫苗給藥小鼠進行剖腹剖胸，切開氣管，向肺插入Atom靜脈導管帶節(jié)3Fr(Atom Medical株式會社日本 東京)，注入生理鹽水ImL,回收該液體。對其反復采液三次，將得到的液體計3mL用作肺泡清洗液。在采取肺清洗液后，從切開后的氣管向鼻腔方向插入Atom靜脈導管，注入ImL的生理鹽水，對從鼻子流出的液體進行采液。將該液體用作鼻清洗液。進而對心臟采血，通過5，OOOrpmUO分鐘的離心分離制備血清。 5.抗流感抗體的定量依據(jù)上述文獻(MizunoD, et al. J Immunol. 2006 ; 176 :1122-30)的記載并通過ELISA分析對鼻腔、肺泡清洗液及血清中的抗流感IgA、IgG含量進行定量。ELISA分析按照BETHYL LABORATORIES公司(美國德克薩斯)的小鼠ELISA定量試劑盒的方法來進行。在 96 孔 Nunc-1mmuno plate (免疫板)(Nalgen Nunc International美國紐約)各孔中加入疫苗I μ g、牛血清白蛋白(BSA，SIGMA美國密蘇里)lyg/mL PBS溶液100 μ L，在4°C下進行一晚固層化反應。然后，用清洗液(50mM Tris, O. 14M NaCl, O. 05%Tween 20，ρΗ8· O)清洗三次，除去疫苗液。在各孔中加入含有O. 15Μ NaClU % BSA的50mMTris-HCl緩沖液(pH 8. O) 200 μ L，在室溫下進行I小時的封閉反應。用清洗液對各孔沖洗三次后，添加以樣品結(jié)合緩沖液(50mM Tris,O. 15M NaCl, I % BSA, O. 05% Tween 20，pH8. O)適量稀釋了的鼻清洗液 肺清洗液或血清ΙΟΟμ L，在室溫下反應2小時。將羊抗小鼠IgA或IgG-辣根過氧化物酶(HRP) (BETHYL LABORATORIES INC.)用作二次抗體，使用TMBMicrowell Peroxidase Substrate System(Kirkegaard&Perry Laboratories, Inc.美國馬里蘭州)進行顯色反應。在各孔中添加100 μ L 2Μ H2SO4 (和光純藥株式會社)，由此停止反應，用SPECTRAmax PLUS 384測定450nm的吸光度。作為用于定量的標準，使用對從上述肺清洗液純化的抗流感IgA及IgGlOng進行同樣操作而得到的吸光度。6.結(jié)果將抗流感HA抗體的誘導結(jié)果示于鼻清洗液中的IgA (左圖1)及血液中的IgG (右圖1)。另外，將各自的測定值示于表I。另外，圖2及表2表示各試驗組的HI效價。(I) HA抗原單獨給藥組(比較例6)的IgA量為24. 77ng/mL, IgG量為O. 54 μ g/mL,與此相對，在HA+SF-10 (實施例1)給藥組中，IgA量為3307. 60ng/mL, IgG量為568. 75 μ g/mL，鼻清洗液中的IgA增強至132倍，血清中的IgG增強至1137倍。確認到本申請發(fā)明的CVP添加粘膜疫苗(HA+SF-10)具有極強的抗體誘導效果(圖1、表I)。(2)對HA+SF-10 (實施例1)給藥組中的抗體產(chǎn)生量而言，與HA+AD載體(比較例I)相比IgA為15. 6倍，IgG為150倍，與HA+CVP (比較例2)相比IgA為10. 7倍，IgG為115. 4倍(圖1、表I)。HA+SF-10中的這樣的顯著優(yōu)異的抗體誘導效果遠遠超過由專利文獻3中公知的粘膜疫苗(HA+AD載體)和專利文獻5、6中公知的CVP的單純組合所預測的范圍。(3) HA+HPC (比較例3)給藥組的抗體產(chǎn)生量與HA單獨給藥組(比較例6)相同或在其以下。另外，HA+AD載體+HPC (比較例4)給藥組的抗體產(chǎn)生量比HA+AD載體(比較例I)低(圖1、表I)。由以上結(jié)果確認到與CVP同樣地在滴鼻劑或粘膜疫苗中作為凝膠化劑眾所周知的HPC在與抗原并用或與AD載體并用時不具有免疫誘導增強效果。因此可推斷AD載體的佐劑效果的增強為不是以僅具有增稠效果的載體而是以AD載體特性為基礎的其增強效果。(4)HA+SF_10(實施例1)給藥組中的抗體產(chǎn)生量與HA+poly (1. C.)(比較例5)相t匕，鼻清洗液中的IgA為11. 4倍，血清中的IgG為2. 3倍(圖1、表I)。由該結(jié)果確認到本申請發(fā)明的CVP添加粘膜疫苗(HA+SF-10)與通過強烈刺激抗原呈現(xiàn)細胞從而促進抗體產(chǎn)生的poly(1.C.)相比，具有更強免疫誘導效果。[表I] 抗體效價
熱消洗液 IgA(ngZmL)Illi 丨gA(pg/mL)
mean S.D.1 S.E.1 I mean I S.D.1 S.E.1 生理鹽水 7.45 4.79 1.51 0.06 0.14 0.04 HA24.77 25.83 8.17 0.54 0.48 0.15
HA+AD 載體 211.94 167.90 53.10 3.84 0.91 0.29r HA+HPC 8.82 4.96 1.65 1.51 1.12 0.37-------
HA+AD 載體 56.92 89.05 29.68 2.46 1,67 0.56
I HPP
HA+CVP 309.34 231.08 77.03 4.93 1.61 0.54 HA+SF-10 3307.6 882.55 294.18 568.75 95.18 31.73
0
HA+poiy([() 289.78 136.40 43.13 246.04 90.93 28.76(5)根據(jù)流感疫苗的國際評價基準，將血液的病毒感染抑制效果HI超過40的疫苗判定為有效，但在HA+AD載體(比較例I)中，超過HI = 40的樣品為50%，以平均值計表示HI = 39。與此相對，在HA+SF-10(實施例1)中，全部例子的超過HI = 40，以平均值計表示HI = 213. 3的高值，另外，與HA+poly (1.C.)(比較例5)的HI = 137. O相比，顯示1. 56倍的強病毒感染抑制效果(圖2、表2)。[表2]HI 效價
權(quán)利要求
1.一種粘膜疫苗，其特征在于，含有以下的組成 (a)包含合成肽和脂質(zhì)的AD載體，所述合成肽包含KnLm的氨基酸序列，其中，η為4_8，m 為 11-20 ； (b)羧基乙烯基聚合物；及 (c)抗原蛋白，所述抗原蛋白為單獨不會產(chǎn)生引起有效的免疫誘導和感染防御效果的量的粘膜免疫IgA及血中免疫IgG的量， 所述粘膜疫苗產(chǎn)生引起有效的免疫誘導和感染防御效果的量的抗原特異性粘膜免疫IgA及血中免疫IgG。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的粘膜疫苗，其中，抗原蛋白(c)為即使利用與AD載體(a)的組合或與羧基乙烯基聚合物(b)的組合也不會產(chǎn)生引起有效的免疫誘導和感染防御效果的量的抗原特異性粘膜免疫IgA及血中免疫IgG的量。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的粘膜疫苗，其中，合成肽包含序列編號I或2的氨基酸序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的粘膜疫苗，其中，脂質(zhì)為卵磷脂、二棕櫚酰磷脂酰膽堿、磷脂酰絲氨酸、磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇、磷脂酰乙醇胺、磷脂酸、月桂酸、肉豆蘧酸、棕櫚酸、硬脂酸及油酸中的至少一種。
5.根據(jù)權(quán)利要求3的粘膜疫苗，其中，脂質(zhì)為二棕櫚酰磷脂酰膽堿、磷脂酰甘油及棕櫚酸的三種脂質(zhì)混合物。
6.根據(jù)權(quán)利要求1的粘膜疫苗，其中，抗原蛋白為源自病原體的鈍化抗原、純化抗原、部分純化抗原、重組抗原或無毒化毒素、成為過敏原因的過敏原。
7.一種粘膜疫苗的制造方法，所述粘膜疫苗含有以下的組成 (a)包含合成肽和脂質(zhì)的AD載體，所述合成肽包含KnLm的氨基酸序列，其中，η為4_8，m 為 11-20 ； (b)羧基乙烯基聚合物；及 (c)抗原蛋白，所述抗原蛋白為單獨不會產(chǎn)生引起有效的免疫誘導的量的粘膜免疫IgA及血中免疫IgG的量， 所述粘膜疫苗產(chǎn)生引起有效的免疫誘導的量的抗原特異性粘膜免疫IgA及血中免疫IgG, 所述方法的特征在于， (1)將所述(a)及(C)懸浮在水中， (2)將加溫和攪拌重復I次以上， (3)進行冷凍干燥， (4)將冷凍干燥體懸浮在生理鹽水中制備成規(guī)定濃度， (5)加入所述(b)的溶液。
全文摘要
本發(fā)明提供一種粘膜疫苗，其特征在于，含有以下的組成(a)包含合成肽和脂質(zhì)的AD載體，所述合成肽包含KnLm的氨基酸序列，其中，n為4-8，m為11-20；(b)羧基乙烯基聚合物；及(c)抗原蛋白，所述抗原蛋白為單獨不會產(chǎn)生引起有效的免疫誘導和感染防御效果的量的粘膜免疫IgA及血中免疫IgG的量，所述粘膜疫苗產(chǎn)生引起有效的免疫誘導和感染防御效果的量的抗原特異性粘膜免疫IgA及血中免疫IgG。本發(fā)明的粘膜疫苗與現(xiàn)有的粘膜疫苗相比，具有更強的抗體產(chǎn)生能力，作為其結(jié)果，能夠以極少量的抗原發(fā)揮優(yōu)異的效果。
文檔編號A61K39/00GK103002908SQ20118001181
公開日2013年3月27日 申請日期2011年3月1日 優(yōu)先權(quán)日2010年3月2日
發(fā)明者木戶博, 水野大 申請人:國立大學法人德島大學