專利名稱：粘膜疫苗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種有效誘導(dǎo)粘膜免疫IgA和血中免疫IgG的粘膜疫苗。
背景技術(shù)：
在專利文獻(xiàn)I及2中，詳細(xì)記載了與現(xiàn)有的鈍化疫苗及類毒素等中的缺點(diǎn)、粘膜疫苗及免疫佐劑的開發(fā)有關(guān)的現(xiàn)狀等。
如這些專利文獻(xiàn)1、2中記載所述，廣泛且深刻地認(rèn)識(shí)到用在作為病毒的自然感染途徑的粘膜中誘導(dǎo)IgA抗體產(chǎn)生的粘膜疫苗來代替向皮下、肌肉內(nèi)等接種的現(xiàn)有疫苗的必要性。特別是作為21世紀(jì)的下一代疫苗，全世界均期待誘導(dǎo)IgA抗體的產(chǎn)生、局部免疫或粘膜免疫的所謂粘膜疫苗的開發(fā)和實(shí)用化，但尚未實(shí)現(xiàn)。本申請(qǐng)發(fā)明人等對(duì)于這樣的課題，發(fā)明了由作為肺表面活性蛋白質(zhì)B及/或肺表面活性蛋白質(zhì)C與脂質(zhì)的復(fù)合體的抗原藥物(AD)載體(vehicle)和由該AD載體和抗原構(gòu)成的粘膜疫苗，并提出了專利申請(qǐng)(專利文獻(xiàn)I)。進(jìn)而，本申請(qǐng)發(fā)明人等發(fā)現(xiàn)通過調(diào)節(jié)AD載體量(V)和抗原量㈧的重量比V/A，可以轉(zhuǎn)換IgA抗體的選擇性產(chǎn)生和IgA · IgG兩抗體產(chǎn)生，并提出了以此為作用機(jī)制的粘膜疫苗的專利申請(qǐng)(專利文獻(xiàn)2)。另外，專利文獻(xiàn)1、2也公開了肺表面活性蛋白質(zhì)B及C的片段(肽)的有效性。進(jìn)而，本申請(qǐng)發(fā)明人等對(duì)肺表面活性蛋白質(zhì)片段的各種變異體研究了抗體產(chǎn)生增強(qiáng)作用，結(jié)果發(fā)明了以合成肽KnLm(其中，η為4_8，m為11-20)為成分的AD載體和包含該AD載體和抗原的粘膜疫苗并提出了專利申請(qǐng)(專利文獻(xiàn)3)，所述合成肽雖然為比專利文獻(xiàn)1、2所公開的部分肽小的肽，但具有抗體產(chǎn)生的強(qiáng)誘導(dǎo)或者增強(qiáng)作用，特別是具有分泌型IgA抗體的單獨(dú)產(chǎn)生、以及分泌型IgA和血中IgG兩種抗體產(chǎn)生的優(yōu)異且有效的誘導(dǎo)作用。另外，對(duì)采用與粘膜疫苗相同的給藥經(jīng)路的滴鼻劑而言，為了提高其粘度并持續(xù)發(fā)揮對(duì)于花粉癥或過敏的效能，廣泛使用有羧基乙烯基聚合物(CVP) (Carboxyvinylpolymer)或羥丙基纖維素(HPC)，另外，使用有以海藻酸鈉為代表的增稠凝膠化劑。例如也已知有含有HPC的粘膜疫苗(專利文獻(xiàn)4)及含有CVP的粘膜應(yīng)用型疫苗制劑(專利文獻(xiàn)
5)及鼻腔內(nèi)噴霧給藥用流感疫苗(專利文獻(xiàn)6)等。另外，在專利文獻(xiàn)7中公開有一種由抗原、佐劑[特別是Poly (1.C.)]及增稠劑(海藻酸鈉等)構(gòu)成的粘膜給藥用的疫苗。專利文獻(xiàn)1:國(guó)際公開W02005/097182號(hào)公報(bào)專利文獻(xiàn)2 :國(guó)際公開W02007/018152號(hào)公報(bào)專利文獻(xiàn)3 :國(guó)際公開W02009/123119號(hào)公報(bào)專利文獻(xiàn)4 :日本特開2008-231343號(hào)公報(bào)專利文獻(xiàn)5 :國(guó)際公開W001/017556號(hào)公報(bào)專利文獻(xiàn)6 :日本特開平03-38529號(hào)公報(bào)專利文獻(xiàn)7 :日本特開2009-209086號(hào)公報(bào)
發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明要解決的課題專利文獻(xiàn)3的粘膜疫苗具有強(qiáng)抗體產(chǎn)生能力，但作為粘膜疫苗的共通的問題點(diǎn)，具有需要比經(jīng)皮注射疫苗更多的抗原。為了進(jìn)行有效的疫苗治療，相對(duì)于作為其目標(biāo)的傳染病的流行范圍，需要充分量的疫苗，在鑒于現(xiàn)狀的抗原生產(chǎn)量規(guī)模的情況下，粘膜疫苗增產(chǎn)很困難。因此，要求對(duì)粘膜疫苗賦予更強(qiáng)的抗體產(chǎn)生能力。本申請(qǐng)發(fā)明的課題在于提供一種改良型粘膜疫苗，所述改良型粘膜疫苗與專利文獻(xiàn)3中記載的粘膜疫苗相比具有更強(qiáng)的抗體產(chǎn)生能力，作為其結(jié)果，能夠以與經(jīng)皮注射疫苗相匹敵那樣的少量的抗原發(fā)揮優(yōu)異的效果。用于解決課題的手段作為進(jìn)一步增強(qiáng)專利文獻(xiàn)3的粘膜疫苗的抗體誘導(dǎo)的方法，本申請(qǐng)發(fā)明人等從滴 鼻劑或粘膜應(yīng)用型疫苗中使用的凝膠化劑(CVP、HPC)中，試驗(yàn)了作用于AD載體，增加運(yùn)送至抗原呈遞細(xì)胞的抗原量并對(duì)粘膜免疫IgA及血中免疫IgG的誘導(dǎo)效果，確認(rèn)了以下內(nèi)容。(I)與專利文獻(xiàn)3的粘膜疫苗(抗原+合成肽+脂質(zhì))或?qū)＠墨I(xiàn)5、6的粘膜疫苗(抗原+CVP)相比，由包含“抗原+合成肽+脂質(zhì)+CVP”的粘膜疫苗具有特別優(yōu)異的抗體誘導(dǎo)能力，其效果大大超過由專利文獻(xiàn)3 (抗原+合成肽+脂質(zhì))和專利文獻(xiàn)5、6 (抗原+CVP)的簡(jiǎn)單的組合所預(yù)測(cè)的范圍。(2)與CVP同樣地作為滴鼻劑或粘膜疫苗的凝膠化劑被廣泛報(bào)告的HPC賦形劑在與抗原并用或者與抗原并用于AD載體的情況下，完全不具有抗體誘導(dǎo)能力，也無法期待誘導(dǎo)粘膜免疫IgA及血中免疫IgG的效果。(3)即使將抗原量減少至專利文獻(xiàn)3的粘膜疫苗(抗原+合成肽+脂質(zhì))的需要量的約1/5以下，“抗原+合成肽+脂質(zhì)+CVP”的粘膜疫苗仍然具有特別強(qiáng)的抗體誘導(dǎo)效果。本發(fā)明是基于以上的新見解而完成的。S卩，本發(fā)明為一種粘膜疫苗，其特征在于，含有以下的組成(a)包含合成肽和脂質(zhì)的AD載體，所述合成肽包含KnLm(其中，η為4_8，m為11-20)的氨基酸序列；(b)羧基乙烯基聚合物；及(C)抗原蛋白，所述抗原蛋白為單獨(dú)不會(huì)產(chǎn)生引起有效的感染防御效果的量的粘膜免疫IgA及血中免疫IgG的量，所述粘膜疫苗產(chǎn)生引起有效的感染防御效果的量的抗原特異性粘膜免疫IgA及血中免疫IgG。在本發(fā)明的粘膜疫苗中，其中，抗原蛋白(C)為即使進(jìn)一步利用與AD載體(a)的組合或與羧基乙烯基聚合物(b)的組合也不會(huì)產(chǎn)生引起有效的感染防御效果的量的抗原特異性粘膜免疫IgA及血中免疫IgG的量。在該粘膜疫苗中的一形態(tài)中，所述合成肽為包含序列編號(hào)I或2的氨基酸序列的肽。另外，在該粘膜疫苗中的其它的方式中，脂質(zhì)為卵磷脂、二棕櫚酰磷脂酰膽堿、磷脂酰絲氨酸、磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇、磷脂酰乙醇胺、磷脂酸、月桂酸、肉豆蘧酸、棕櫚酸、硬脂酸及油酸中的至少一種。進(jìn)一步具體而言，脂質(zhì)為二棕櫚酰磷脂酰膽堿、磷脂酰甘油及棕櫚酸的三種脂質(zhì)混合物。
在該粘膜疫苗中的又一方式中，抗原包括源自病原體的鈍化抗原、純化抗原、部分純化抗原、重組抗原或無毒化毒素、成為過敏原因的過敏原。進(jìn)而，本發(fā)明為一種粘膜疫苗的制造方法，所述粘膜疫苗含有以下的組成(a)包含合成肽和脂質(zhì)的AD載體，所述合成肽包含KnLm(其中，η為4_8，m為11-20)的氨基酸序列；(b)羧基乙烯基聚合物；及(C)抗原蛋白，所述抗原蛋白為單獨(dú)不會(huì)產(chǎn)生引起有效的免疫誘導(dǎo)的量的粘膜免疫IgA及血中免疫IgG的量，所述粘膜疫苗產(chǎn)生引起有效的免疫誘導(dǎo)和感染防御效果的量的抗原特異性粘膜免疫IgA及血中免疫IgG， 所述方法的特征在于，(I)將所述(a)及(C)懸浮在水中，(2)將加溫和攪拌重復(fù)I次以上，(3)進(jìn)行冷凍干燥，(4)將冷凍干燥體懸浮在生理鹽水中并制備成規(guī)定濃度，(5)加入所述(b)的溶液。在本發(fā)明中，所謂“引起有效的免疫誘導(dǎo)的量的粘膜免免疫IgA及血中免疫IgG”例如為血液的病毒感染抑制效果HI值為國(guó)際評(píng)價(jià)基準(zhǔn)以上那樣的量的IgA及IgG。需要說明的是，在以下的說明中，有時(shí)將包含合成肽和脂質(zhì)的組合物記為“AD載體”，將包含該AD載體和所述抗原的組合物記為“粘膜疫苗”。這些“AD載體”及“粘膜疫苗”與專利文獻(xiàn)3中所公開的載體及疫苗的實(shí)施性相同。進(jìn)而，有時(shí)將在該粘膜疫苗中添加了CVP的組合物記為“CVP添加粘膜疫苗”。另外，對(duì)本申請(qǐng)發(fā)明而言，關(guān)于所述的“脂質(zhì)”，含有專利文獻(xiàn)1-3的公開內(nèi)容，關(guān)于“合成肽”及“AD載體”，含有專利文獻(xiàn)3的公開內(nèi)容。發(fā)明效果本申請(qǐng)發(fā)明的CVP添加粘膜疫苗具有疫苗抗原特異性IgA及IgG抗體的極強(qiáng)的誘導(dǎo)效果和遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過所誘導(dǎo)的抗體的國(guó)際基準(zhǔn)的強(qiáng)病毒感染抑制效果(HI效果)。即使與專利文獻(xiàn)3中記載的粘膜疫苗或者“抗原+CVP疫苗”(專利文獻(xiàn)5、6)相比，這些效果也極其顯著，為無法由專利文獻(xiàn)3的粘膜疫苗效果和專利文獻(xiàn)5、6的CVP效果預(yù)測(cè)的優(yōu)良效果。由于這樣的強(qiáng)抗體誘導(dǎo)能力，可通過含有比現(xiàn)有的粘膜疫苗更少量的抗原來實(shí)現(xiàn)需要的感染防御效果。即，本申請(qǐng)發(fā)明的CVP添加粘膜疫苗即使將抗原量減少至現(xiàn)有的粘膜疫苗(抗原+合成肽+脂質(zhì))中使用的抗原量的1/5以下，也顯示特別強(qiáng)的抗體誘導(dǎo)效果。例如如試驗(yàn)例2所示，專利文獻(xiàn)3的粘膜疫苗在將流感抗原用作抗原的情況下，即使抗原量為O. 2 μ g，血液的病毒感染抑制效果HI也未達(dá)到流感疫苗的國(guó)際評(píng)價(jià)基準(zhǔn)即HI =40，但本發(fā)明的CVP添加粘膜疫苗中的抗原量即使為O.1 μ g，進(jìn)而為O. 03 μ g，也顯示HI值為100以上這樣的優(yōu)異的病毒感染抑制效果。進(jìn)而，本申請(qǐng)發(fā)明的CVP添加粘膜疫苗的組合物(AD載體、CVP)本身沒有抗原識(shí)別細(xì)胞刺激效果，因此，引起由給藥的疫苗抗原之外的抗原導(dǎo)致的意外的副作用，例如自體免疫性疾病、疫苗接種后的過敏惡化等的可能性極低。另外，根據(jù)本發(fā)明的粘膜疫苗制造方法，可以制造一種具有更高的抗原特異性粘膜免疫IgA及血中免疫IgG產(chǎn)生能力的粘膜疫苗。


圖1為試驗(yàn)I的結(jié)果即將實(shí)施例1、比較例1-5的各疫苗、HA抗原分別對(duì)小鼠經(jīng)鼻給藥時(shí)的鼻清洗液IgA量(左)和血清IgG量(右)；圖2為試驗(yàn)I的結(jié)果即將實(shí)施例1、比較例1、5的各疫苗、HA抗原及作為比較對(duì)象的HA+AD載體分別對(duì)小鼠經(jīng)鼻給藥時(shí)的抗流感病毒HA抗體所顯示的HI效價(jià)；圖3為在試驗(yàn)2中，用內(nèi)毒素(LPS)、poly(1.C.)和SF-1O (CVP+AD載體)分別刺激抗原遞呈樹狀細(xì)胞并對(duì)細(xì)胞膜的活化表示分子(MHC I1、⑶40、⑶80(B7-1)及⑶86(B7_2))的表達(dá)水平進(jìn)行測(cè)定的結(jié)果。左圖表示各膜分子的表達(dá)量增加而判定為陽性的細(xì)胞(超過右側(cè)的點(diǎn)圖表中由用作對(duì)照的生理鹽水處理而確定的中央附近的陰性值上限顯示條的值的細(xì)胞)的總細(xì)胞數(shù)中的比例(％)，右圖為利用流式細(xì)胞儀的測(cè)定結(jié)果對(duì)細(xì)胞膜上的活化 表示分子的量進(jìn)行可視化定量的圖；圖4為試驗(yàn)4的結(jié)果，表示感染的流感病毒PFU量和生存率的關(guān)系；圖5為試驗(yàn)4的結(jié)果，表示對(duì)小鼠(各組10只)經(jīng)鼻給藥實(shí)施例1、實(shí)施例5、比較例5及比較例6的各疫苗后，感染50PFU的流感病毒時(shí)的生存率的變化；圖6為試驗(yàn)4的結(jié)果，表示對(duì)小鼠(各組10只)經(jīng)鼻給藥實(shí)施例1、實(shí)施例5、比較例5及比較例6的各疫苗后，感染800PFU的流感病毒時(shí)的生存率的變化；圖7為表示試驗(yàn)6結(jié)果的透射型電子顯微鏡照片。㈧為比較例I的粘膜疫苗，(B)為實(shí)施例1的CVP添加粘膜疫苗和其部分?jǐn)U大圖(右圖)；圖8為在試驗(yàn)7中，利用流式細(xì)胞儀對(duì)由樹狀細(xì)胞檢測(cè)的熒光標(biāo)記抗原量進(jìn)行測(cè)定的結(jié)果。將用單獨(dú)給藥HA抗原時(shí)在樹狀細(xì)胞中檢測(cè)的抗原熒光標(biāo)記量設(shè)為I時(shí)，以各自的測(cè)定條件下促進(jìn)熒光標(biāo)記量的倍數(shù)作為縱軸，以“Fold versus HA” =[測(cè)定各樣品時(shí)的MFI]/[單獨(dú)添加HA的樹狀細(xì)胞的MFI]的形式進(jìn)行表示。MF1:平均熒光強(qiáng)度** p< O. Olvs. HA(n = 3)；圖9為在試驗(yàn)8中，用poly (1. C. )、SF-1O (CVP+AD載體)分別刺激抗原遞呈樹狀細(xì)胞并對(duì)細(xì)胞膜的活化表示分子(CD86)的表達(dá)水平進(jìn)行測(cè)定的結(jié)果?！鯙闊oHA抗原蛋白，■為有HA抗原蛋白的結(jié)果。MF1:平均熒光強(qiáng)度，* p < O. 05vs.僅佐劑(Adjuvant alone)(η = 3)；圖10為在試驗(yàn)9中，在抗原存在下及不存在下對(duì)小鼠經(jīng)鼻給藥SF-1O (CVP+AD載體)佐劑并對(duì)由鼻腔組織制備的樹狀細(xì)胞的CD86表達(dá)水平進(jìn)行測(cè)定的結(jié)果。MF1:平均熒光強(qiáng)度。
具體實(shí)施例方式本申請(qǐng)發(fā)明的CVP添加粘膜疫苗包含以下的組成。合成肽是包含KnLm(其中，η為4_8，m為11-20)的氨基酸序列的合成肽。對(duì)該KnLm而言，N端側(cè)的η個(gè)K(Lys)殘基和C端側(cè)的m個(gè)L殘基連接。這樣的合成肽為例如以下的任一種肽。需要說明的是，括弧內(nèi)為肽的簡(jiǎn)稱。另外，氨基酸殘基由一個(gè)文字符號(hào)表示。
序列編號(hào)I (K6L 16) KKKKKKLLLLLLLLLLLLLLLL序列編號(hào)2 (K6L11) KKKKKKLLLLLLLLLLL序列編號(hào)I (K6L16)由N端側(cè)的6個(gè)K(Lys)殘基和C端側(cè)的16個(gè)L殘基構(gòu)成,序列編號(hào)2(K6L11)由N端側(cè)的6個(gè)K(Lys)殘基和C端側(cè)的11個(gè)L殘基構(gòu)成。這些合成肽使用依據(jù)公知的化學(xué)合成法所制備的純度95%以上的材料。MM作為磷脂質(zhì)，優(yōu)選使用肺表面活性物質(zhì)含有的磷脂質(zhì)，例如卵磷脂、二棕櫚酰磷脂酰膽堿、磷脂酰絲氨酸、磷脂酰甘油等。另外，可以使用磷脂酰肌醇、磷脂酰乙醇胺、磷脂酸及鞘磷脂等。另外，作為脂肪酸，可以使用月桂酸、肉豆蘧酸、棕櫚酸、硬脂酸、棕櫚油酸及油酸等。進(jìn)而可以使用源自肺的膨脹活躍的鯨、海豚等水生動(dòng)物的脂質(zhì)。 羧某乙烯某聚合物(CVP)
CVP為以丙烯酸作為主要成分進(jìn)行聚合而得到的親水性聚合物，可以使用HIVISffAKO 103, HIVISffAKO 104, HIVISffAKO 105、Sigma 公司制 pAA130 (Sigma, St. Louis,MO, CatNo. 181293)、pAA450 (Sigma, CatNo. 181285)、pAA1250 (Sigma, CatNo. 306215)等市售品。其中，優(yōu)選化妝品及醫(yī)藥品用凝膠的制作中所通用的HIVISWAKO 104、Sigma公司制pAA130、pAA1250?？梢杂眉兯蛘呱睇}水在超聲波處理下將CVP制作0. 2-2. O重量％溶解液后，用NaOH中和液進(jìn)行pH 5. 0-10. 5的制作，但優(yōu)選選擇不會(huì)影響疫苗抗原的穩(wěn)定性的pH。例如在流感裂解疫苗抗原的情況下，pH被調(diào)節(jié)為6. 8-8. 0，優(yōu)選pH為7. 0-7. 2。技厘抗原含有用于疫苗的經(jīng)高度純化的純度為約90%以上的源自細(xì)菌的抗原、病毒抗原、類毒素等蛋白質(zhì)、糖蛋白質(zhì)、過敏原、高分子糖質(zhì)及核酸等抗原分子。例如為水痘病毒、麻疹病毒、流行性腮腺炎病毒、脊髓灰質(zhì)炎病毒、輪狀病毒、流感病毒、腺病毒、皰疹病毒、嚴(yán)重急性呼吸綜合征(SARS)病毒、西尼羅病毒、漢坦病毒、登革病毒、日本腦炎病毒、黃熱病毒、蜱傳腦炎病毒、HIV病毒、C型肝炎病毒、百日咳菌、腦膜炎菌、流感b型菌、肺炎菌、霍亂弧菌、瘧疾病原體、昏睡病病原體等的疫苗用的抗原。這些抗原制備即使其單獨(dú)、特別是與AD載體(a)或與羧基乙烯基聚合物(CVP)組合也不會(huì)產(chǎn)生引起有效的免疫誘導(dǎo)的量的抗原特異性粘膜免疫IgA及血中免疫IgG的量進(jìn)行使用。另外，在流感抗原蛋白的情況下，除HA抗原分子以外，含有M蛋白、神經(jīng)氨酸酶及核蛋白等。在以下的說明中，抗原蛋白量是指含有這些抗原分子的蛋白質(zhì)總量。對(duì)使用的批量流感疫苗而言，HA抗原分子自身的量為抗原總蛋白量的約50 %。接著，對(duì)由這些材料制備AD載體及CVP添加粘膜疫苗的方法進(jìn)行說明。AD載體的制備以任意比例混合上述脂質(zhì)中的幾種，作為脂質(zhì)量，例如以成為10mg/mL的濃度的方式懸浮于氯仿甲醇(2 : l(v/v))混合液，作為脂質(zhì)成分。另外，合成肽以濃度為例如5. 0mg/mL的方式溶解于乙醇。接著，混合該脂質(zhì)成分和合成肽。對(duì)混合比而言，合成肽為約0. 2 約12. O干燥重量％，脂質(zhì)為約88 約99. 8干燥重量％。使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器將該混合物在約40°C下進(jìn)行干固，以任意濃度再懸浮于10%乙醇，在約45°C的水浴中振蕩混合15分鐘左右，制備均勻分散液并冷凍干燥。將該干燥物在約_30°C下保存，每次在使用時(shí)加入純水或生理鹽水使其懸浮后，使用超聲波、均化器、混合器、振蕩儀等制成均勻分散液。CVP添加粘膜疫苗的制備以任意比例混合上述AD載體、CVP及抗原。即，在流感疫苗的情況下，以使AD載體量(V)相對(duì)于疫苗中的抗原蛋白量(A)的干燥重量比V/A為期望的值的方式在疫苗原液中添加混合AD載體液進(jìn)行制備。對(duì)每只小鼠給藥的抗原蛋白的干燥重量(A)為約0.01 約10 μ g/kg體重，優(yōu)選為約O. 03 約5. O μ g/Kg體重。該抗原量為專利文獻(xiàn)3的粘膜疫苗(抗原+AD載體)中的抗原量(約O.1 50 μ g/kg體重，優(yōu)選為約O. 3 30 μ g/Kg體重)的1/5以下。在這樣的抗原量中，用于優(yōu)先且選擇性地誘導(dǎo)IgA抗體產(chǎn)生的V/A優(yōu)選為約O.1 約1. O。另外，用于誘導(dǎo)IgA及IgG兩種抗體產(chǎn)生的V/A為約1. O 約100，優(yōu)選采用約5 約20的范圍。在如上所述的V/A中，抗原的約60%以上與AD載體結(jié)合，由此得到的粘膜免疫疫苗可有效地誘導(dǎo)IgA抗體產(chǎn)生及/或IgG抗體產(chǎn)生。另外，加入了 CVP的最終經(jīng)鼻給藥疫苗液中的CVP濃度為約O. 1% 1. 0%，優(yōu)選以O(shè). 3 % O. 8 %的比例添加。另外，為了均勻地混合AD載體、抗原及CVP，可以使用均化器、混合器、振蕩儀及攪拌器等。具體而言，如下述實(shí)施例1所示，可以如下制備CVP添加粘膜疫苗在混合抗原蛋白和AD載體后，進(jìn)行3分鐘超聲波處理，進(jìn)一步在室溫下旋轉(zhuǎn)混合2小時(shí)后，最后加入等量的I % CVP生理鹽水溶液。除了添加CVP之外，該方法與專利文獻(xiàn)3中記載的方法相同。但是，該方法存在如下不良情況有時(shí)由于超聲波處理產(chǎn)生的發(fā)熱使病毒抗原失活；有時(shí)由于使用機(jī)器和材料的種類、振蕩器的大小、振蕩器的狀態(tài)等，超聲波處理行程難以保持一定的條件。因此，優(yōu)選由實(shí)施例7所示那樣的以下工序構(gòu)成的制造方法。(I)將AD載體和抗原蛋白懸浮在水(純水)中(2)將加溫和攪拌重復(fù)I次以上(3)冷凍干燥(4)將冷凍干燥體懸浮在生理鹽水中并制備成規(guī)定濃度(5)添加溶解在生理鹽水中的CVP溶液該方法不僅解決了由超聲波處理引起的上述問題點(diǎn)，而且如后述試驗(yàn)5中所示那樣可以更高地產(chǎn)生抗原特異性的IgA及IgG，是優(yōu)異的方法。制備的CVP添加粘膜疫苗也可以以一次給藥使用，但優(yōu)選以二次給藥(初次免疫和二次免疫)或三次給藥(初次免疫、二次免疫、三次免疫)的形式使用。通過這樣的多次免疫處置，可以顯著地增加IgA及IgG的抗體效價(jià)。另外，二次或三次疫苗給藥以I周 3周，優(yōu)選以約2周的間隔進(jìn)行。進(jìn)而，本申請(qǐng)發(fā)明的CVP添加粘膜疫苗的給藥路徑除鼻腔之夕卜，也可以對(duì)口腔內(nèi)或陰道給藥(例如Lubrizol Pharmaceutical Bulletin,Polymers forPharmaceutical Applications, Lubrizol Advanced Materials, Inc.2008)。以下，示出實(shí)施例對(duì)本申請(qǐng)發(fā)明進(jìn)行更詳細(xì)且具體的說明，但本申請(qǐng)發(fā)明并不限定于以下的例子。實(shí)施例1[包含超聲波處理的制造工序]
首先，如下制備AD載體。以75 : 25 : 10 (w/w/w)的比例混合二棕櫚酰磷脂酰膽堿(DPPC)、磷脂酰甘油(PG)及棕櫚酸(PA)，以磷脂質(zhì)量計(jì)為10mg/ml的濃度的方式懸濁于氯仿甲醇(2 : l(v/v))混合液，作為脂質(zhì)成分。另外，將純度95%以上的合成肽K6L16 (KKKKKKLLLLLLLLLLLLLLLL) (GenScript 公司制)以成為 5. Omg/mL 的方式溶解在甲醇中。以重量比計(jì)磷脂質(zhì)成分K6L16= 100 2的方式混合脂質(zhì)成分(DPPC PG PA =75 : 25 : 10，w/w/w)溶液和K6L16肽溶液，使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器在40°C下進(jìn)行干固。將其以磷脂質(zhì)量計(jì)為4mg/mL的方式再懸浮于10%乙醇，在45°C的水浴中振蕩混合15分鐘，制備均勻分散液。對(duì)其進(jìn)行冷凍干燥并作為AD載體在_30°C下進(jìn)行保存。接著，使用上述AD載體如下制備CVP添加粘膜疫苗。冷凍干燥后的AD載體必須懸浮在生理鹽水中使用。流感疫苗(HA)抗原使用由 阪大微生物病研究會(huì)提供的A/NewCaledonia/20/99 (HlNl)、1. 94mg蛋白質(zhì)/mL(磷酸鈉緩沖液、氯化鈉、乙基汞硫代水楊酸鈉溶液=ImL中溶解磷酸氫鈉水合物3. 53mg、磷酸二氫鈉O. 54mg、氯化鈉8. 50mg及乙基汞硫代水楊酸鈉O. 008mg)。對(duì)疫苗和AD載體的混合量而言，以AD載體溶液的磷脂質(zhì)量(V)相對(duì)于抗原溶液的蛋白量㈧的量比V/A = 10的方式進(jìn)行混合，以30秒的間隔對(duì)超聲波處理重復(fù)三次開啟關(guān)閉，進(jìn)行由合計(jì)90秒的開啟和90秒的關(guān)閉構(gòu)成的合計(jì)3分鐘的超聲波處理(model S_250D、Branson Ultrasonics Danbury),進(jìn)一步在室溫下旋轉(zhuǎn)混合2小時(shí)后，溶解在生理鹽水中，以最終濃度為O. 5%的方式加入調(diào)節(jié)成中性的I % CVP (HIVISWAKO 104)。即，對(duì)每只小鼠單鼻孔給藥2 μ L進(jìn)行兩鼻孔給藥合計(jì)4 μ L，該4 μ L中所含組成為流感疫苗(HA)抗原蛋白量/AD載體溶液的磷脂質(zhì)量/CVP重量=0. 2 μ g/2. O μ g/20 μ go另夕卜，該CVP添加粘膜疫苗的pH設(shè)為維持HA抗原蛋白的抗原性的范圍(7. 0-7. 2)。以下，將該CVP添加粘膜疫苗記為“HA+SF-10”。另外，如上所述，SF-10量為AD載體(2. Oyg)+CVPQOyg) = 22 μ g，但在下述說明中，用作為佐劑的載體作用的基本骨架的AD載體的磷脂質(zhì)量進(jìn)行表記，記為SF-10(2. 0μ g)。其它的實(shí)施例中的SF-10量也用除CVP量以外的值進(jìn)行記載。實(shí)施例2根據(jù)實(shí)施例1的方法制備HA抗原蛋白量為0.1 μ g的CVP添加粘膜疫苗。HA抗原蛋白、AD載體及CVP的混合比與實(shí)施例1相同(即，含有抗原蛋白量10倍的AD載體和最終濃度0.5%的CVP)。實(shí)施例3根據(jù)實(shí)施例1的方法制備HA抗原蛋白量為0. 03 μ g的CVP添加粘膜疫苗。HA抗原蛋白、AD載體及CVP的混合比與實(shí)施例1相同(即含有抗原蛋白量10倍的AD載體和最終濃度0.5%的CVP)。比較例I制備專利文獻(xiàn)3的粘膜疫苗(HA+AD載體)。HA抗原蛋白及AD載體使用與實(shí)施例1相同的物質(zhì)，根據(jù)實(shí)施例1制備疫苗。HA抗原蛋白量為0.2 μ g，AD載體量為2.0. μ g。比較例2
制備專利文獻(xiàn)5、6中所公開的粘膜疫苗(HA+CVP)。HA抗原蛋白及CVP使用與實(shí)施例I相同的物質(zhì)，根據(jù)實(shí)施例1制備疫苗。HA抗原蛋白量為O. 2 μ g，CVP為最終濃度O. 5 %。比較例3制備專利文獻(xiàn)4中所公開的粘膜疫苗(HA+HPC)。HA抗原蛋白使用與實(shí)施例1相同的物質(zhì)，HPC使用市售的HPC 6. 0-10. O (和光純藥)。根據(jù)實(shí)施例1制備疫苗。HA抗原蛋白量為O. 2 μ g，HPC量為20 μ g。比較例4·制備在專利文獻(xiàn)3的HA+AD載體中進(jìn)一步添加了 HPC的粘膜疫苗(HA+AD載體+HPC)。HA+AD載體使用與比較例I相同的物質(zhì)，HPC使用與比較例3相同的物質(zhì)，根據(jù)實(shí)施例I制備疫苗。HA抗原蛋白量為O. 2 μ g，AD載體量為2. O μ g，HPC量為20 μ g。比較例5根據(jù)文獻(xiàn)((Asah1-OzakiY et al. , Microbes Infect 2006;8:2706-2714，Ichinohe T，et al.，J Virol 2005 ；79(5) :2910-2919)中記載的方法制備含有樹狀細(xì)胞的Toll樣受體(TLR)的配合基、即強(qiáng)烈刺激抗原呈遞細(xì)胞而促進(jìn)抗體產(chǎn)生的poly(1.C.)(Alexis Corp)的粘膜疫苗(HA+poly (1. C.))。HA 抗原蛋白量為 0. 2 μ g，poly (1. C.)量為2 μ g0比較例6用生理鹽水稀釋HA抗原并將其用作疫苗。每只的HA抗原蛋白給藥量為0. 2 μ g。[試驗(yàn)I]使用小鼠，對(duì)經(jīng)鼻粘膜疫苗的抗體產(chǎn)生增強(qiáng)作用進(jìn)行試驗(yàn)。1.粘膜疫苗· HA+SF-10 (實(shí)施例1)· HA+AD載體(比較例I)· HA+CVP (比較例 2)· HA+HPC (比較例 3)· HA+AD 載體 +HPC (比較例 4)· HA+poly (1. C.)(比較例 5)· HA單獨(dú)(比較例6)2.動(dòng)物從日本SLC株式會(huì)社(日本靜岡)購(gòu)入6-8周齡的雌BALB/c雌小鼠后使用。全部的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)由德島大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心的感染動(dòng)物舍(P2水平)進(jìn)行，按照德島大學(xué)醫(yī)學(xué)部動(dòng)物實(shí)驗(yàn)委員會(huì)的操作規(guī)則來進(jìn)行。3.免疫法在疫苗的經(jīng)鼻給藥中，將上述I的5種粘膜疫苗以單鼻孔2μ L進(jìn)行兩側(cè)給藥，將合計(jì)4μ L的疫苗向用氯胺酮(62. 6mg/Kg)及甲苯噻嗪(12. 4mg/Kg)麻醉的小鼠的兩側(cè)鼻腔點(diǎn)鼻給藥。對(duì)照使用與疫苗液等量的生理鹽水給藥組及比較例6 (HA抗原蛋白單獨(dú)給藥組)。各組由9_10只小鼠構(gòu)成。免疫對(duì)于初次免疫后第二周的由同樣的組成構(gòu)成的樣品，對(duì)各組作為2次免疫進(jìn)行等量經(jīng)鼻給藥。在二次免疫后在第二周通過同樣的方法進(jìn)行三次免疫，然后，在第二周采集樣品。另外，疫苗給藥合計(jì)進(jìn)行三次，但即使以二次免疫結(jié)束也可得到基本相同的結(jié)果。4.小鼠鼻腔·肺泡清洗液及血清的制備制備三次免疫后第二周的小鼠的鼻腔·肺泡清洗液及血清并對(duì)病毒HA抗原特異性的 IgA、IgG進(jìn)行測(cè)定。根據(jù)文獻(xiàn)(Mizuno D, Ide-Kurihara M, Ichinomiya T,Kubo I,KidoH. Modified pulmonary surfactant is a potentadjuvant that stimulates the mucosalIgA production in response to the influenza virus antigen. J Tmmunol.2006 ； 176 1122-30)記載的方法如下進(jìn)行。在戊巴比妥麻醉下對(duì)疫苗給藥小鼠進(jìn)行剖腹剖胸，切開氣管，向肺插入Atom靜脈導(dǎo)管帶節(jié)3Fr(Atom Medical株式會(huì)社日本 東京)，注入生理鹽水ImL,回收該液體。對(duì)其反復(fù)采液三次，將得到的液體計(jì)3mL用作肺泡清洗液。在采取肺清洗液后，從切開后的氣管向鼻腔方向插入Atom靜脈導(dǎo)管，注入ImL的生理鹽水，對(duì)從鼻子流出的液體進(jìn)行采液。將該液體用作鼻清洗液。進(jìn)而對(duì)心臟采血，通過5，OOOrpmUO分鐘的離心分離制備血清。 5.抗流感抗體的定量依據(jù)上述文獻(xiàn)(MizunoD, et al. J Immunol. 2006 ; 176 :1122-30)的記載并通過ELISA分析對(duì)鼻腔、肺泡清洗液及血清中的抗流感IgA、IgG含量進(jìn)行定量。ELISA分析按照BETHYL LABORATORIES公司(美國(guó)德克薩斯)的小鼠ELISA定量試劑盒的方法來進(jìn)行。在 96 孔 Nunc-1mmuno plate (免疫板)(Nalgen Nunc International美國(guó)紐約)各孔中加入疫苗I μ g、牛血清白蛋白(BSA，SIGMA美國(guó)密蘇里)lyg/mL PBS溶液100 μ L，在4°C下進(jìn)行一晚固層化反應(yīng)。然后，用清洗液(50mM Tris, O. 14M NaCl, O. 05%Tween 20，ρΗ8· O)清洗三次，除去疫苗液。在各孔中加入含有O. 15Μ NaClU % BSA的50mMTris-HCl緩沖液(pH 8. O) 200 μ L，在室溫下進(jìn)行I小時(shí)的封閉反應(yīng)。用清洗液對(duì)各孔沖洗三次后，添加以樣品結(jié)合緩沖液(50mM Tris,O. 15M NaCl, I % BSA, O. 05% Tween 20，pH8. O)適量稀釋了的鼻清洗液 肺清洗液或血清ΙΟΟμ L，在室溫下反應(yīng)2小時(shí)。將羊抗小鼠IgA或IgG-辣根過氧化物酶(HRP) (BETHYL LABORATORIES INC.)用作二次抗體，使用TMBMicrowell Peroxidase Substrate System(Kirkegaard&Perry Laboratories, Inc.美國(guó)馬里蘭州)進(jìn)行顯色反應(yīng)。在各孔中添加100 μ L 2Μ H2SO4 (和光純藥株式會(huì)社)，由此停止反應(yīng)，用SPECTRAmax PLUS 384測(cè)定450nm的吸光度。作為用于定量的標(biāo)準(zhǔn)，使用對(duì)從上述肺清洗液純化的抗流感IgA及IgGlOng進(jìn)行同樣操作而得到的吸光度。6.結(jié)果將抗流感HA抗體的誘導(dǎo)結(jié)果示于鼻清洗液中的IgA (左圖1)及血液中的IgG (右圖1)。另外，將各自的測(cè)定值示于表I。另外，圖2及表2表示各試驗(yàn)組的HI效價(jià)。(I) HA抗原單獨(dú)給藥組(比較例6)的IgA量為24. 77ng/mL, IgG量為O. 54 μ g/mL,與此相對(duì)，在HA+SF-10 (實(shí)施例1)給藥組中，IgA量為3307. 60ng/mL, IgG量為568. 75 μ g/mL，鼻清洗液中的IgA增強(qiáng)至132倍，血清中的IgG增強(qiáng)至1137倍。確認(rèn)到本申請(qǐng)發(fā)明的CVP添加粘膜疫苗(HA+SF-10)具有極強(qiáng)的抗體誘導(dǎo)效果(圖1、表I)。(2)對(duì)HA+SF-10 (實(shí)施例1)給藥組中的抗體產(chǎn)生量而言，與HA+AD載體(比較例I)相比IgA為15. 6倍，IgG為150倍，與HA+CVP (比較例2)相比IgA為10. 7倍，IgG為115. 4倍(圖1、表I)。HA+SF-10中的這樣的顯著優(yōu)異的抗體誘導(dǎo)效果遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過由專利文獻(xiàn)3中公知的粘膜疫苗(HA+AD載體)和專利文獻(xiàn)5、6中公知的CVP的單純組合所預(yù)測(cè)的范圍。(3) HA+HPC (比較例3)給藥組的抗體產(chǎn)生量與HA單獨(dú)給藥組(比較例6)相同或在其以下。另外，HA+AD載體+HPC (比較例4)給藥組的抗體產(chǎn)生量比HA+AD載體(比較例I)低(圖1、表I)。由以上結(jié)果確認(rèn)到與CVP同樣地在滴鼻劑或粘膜疫苗中作為凝膠化劑眾所周知的HPC在與抗原并用或與AD載體并用時(shí)不具有免疫誘導(dǎo)增強(qiáng)效果。因此可推斷AD載體的佐劑效果的增強(qiáng)為不是以僅具有增稠效果的載體而是以AD載體特性為基礎(chǔ)的其增強(qiáng)效果。(4)HA+SF_10(實(shí)施例1)給藥組中的抗體產(chǎn)生量與HA+poly (1. C.)(比較例5)相t匕，鼻清洗液中的IgA為11. 4倍，血清中的IgG為2. 3倍(圖1、表I)。由該結(jié)果確認(rèn)到本申請(qǐng)發(fā)明的CVP添加粘膜疫苗(HA+SF-10)與通過強(qiáng)烈刺激抗原呈現(xiàn)細(xì)胞從而促進(jìn)抗體產(chǎn)生的poly(1.C.)相比，具有更強(qiáng)免疫誘導(dǎo)效果。[表I] 抗體效價(jià)
熱消洗液 IgA(ngZmL)Illi 丨gA(pg/mL)
mean S.D.1 S.E.1 I mean I S.D.1 S.E.1 生理鹽水 7.45 4.79 1.51 0.06 0.14 0.04 HA24.77 25.83 8.17 0.54 0.48 0.15
HA+AD 載體 211.94 167.90 53.10 3.84 0.91 0.29r HA+HPC 8.82 4.96 1.65 1.51 1.12 0.37-------
HA+AD 載體 56.92 89.05 29.68 2.46 1,67 0.56
I HPP
HA+CVP 309.34 231.08 77.03 4.93 1.61 0.54 HA+SF-10 3307.6 882.55 294.18 568.75 95.18 31.73
0
HA+poiy([() 289.78 136.40 43.13 246.04 90.93 28.76(5)根據(jù)流感疫苗的國(guó)際評(píng)價(jià)基準(zhǔn)，將血液的病毒感染抑制效果HI超過40的疫苗判定為有效，但在HA+AD載體(比較例I)中，超過HI = 40的樣品為50%，以平均值計(jì)表示HI = 39。與此相對(duì)，在HA+SF-10(實(shí)施例1)中，全部例子的超過HI = 40，以平均值計(jì)表示HI = 213. 3的高值，另外，與HA+poly (1.C.)(比較例5)的HI = 137. O相比，顯示1. 56倍的強(qiáng)病毒感染抑制效果(圖2、表2)。[表2]HI 效價(jià)
權(quán)利要求
1.一種粘膜疫苗，其特征在于，含有以下的組成 (a)包含合成肽和脂質(zhì)的AD載體，所述合成肽包含KnLm的氨基酸序列，其中，η為4_8，m 為 11-20 ； (b)羧基乙烯基聚合物；及 (c)抗原蛋白，所述抗原蛋白為單獨(dú)不會(huì)產(chǎn)生引起有效的免疫誘導(dǎo)和感染防御效果的量的粘膜免疫IgA及血中免疫IgG的量， 所述粘膜疫苗產(chǎn)生引起有效的免疫誘導(dǎo)和感染防御效果的量的抗原特異性粘膜免疫IgA及血中免疫IgG。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的粘膜疫苗，其中，抗原蛋白(c)為即使利用與AD載體(a)的組合或與羧基乙烯基聚合物(b)的組合也不會(huì)產(chǎn)生引起有效的免疫誘導(dǎo)和感染防御效果的量的抗原特異性粘膜免疫IgA及血中免疫IgG的量。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的粘膜疫苗，其中，合成肽包含序列編號(hào)I或2的氨基酸序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的粘膜疫苗，其中，脂質(zhì)為卵磷脂、二棕櫚酰磷脂酰膽堿、磷脂酰絲氨酸、磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇、磷脂酰乙醇胺、磷脂酸、月桂酸、肉豆蘧酸、棕櫚酸、硬脂酸及油酸中的至少一種。
5.根據(jù)權(quán)利要求3的粘膜疫苗，其中，脂質(zhì)為二棕櫚酰磷脂酰膽堿、磷脂酰甘油及棕櫚酸的三種脂質(zhì)混合物。
6.根據(jù)權(quán)利要求1的粘膜疫苗，其中，抗原蛋白為源自病原體的鈍化抗原、純化抗原、部分純化抗原、重組抗原或無毒化毒素、成為過敏原因的過敏原。
7.一種粘膜疫苗的制造方法，所述粘膜疫苗含有以下的組成 (a)包含合成肽和脂質(zhì)的AD載體，所述合成肽包含KnLm的氨基酸序列，其中，η為4_8，m 為 11-20 ； (b)羧基乙烯基聚合物；及 (c)抗原蛋白，所述抗原蛋白為單獨(dú)不會(huì)產(chǎn)生引起有效的免疫誘導(dǎo)的量的粘膜免疫IgA及血中免疫IgG的量， 所述粘膜疫苗產(chǎn)生引起有效的免疫誘導(dǎo)的量的抗原特異性粘膜免疫IgA及血中免疫IgG, 所述方法的特征在于， (1)將所述(a)及(C)懸浮在水中， (2)將加溫和攪拌重復(fù)I次以上， (3)進(jìn)行冷凍干燥， (4)將冷凍干燥體懸浮在生理鹽水中制備成規(guī)定濃度， (5)加入所述(b)的溶液。
全文摘要
本發(fā)明提供一種粘膜疫苗，其特征在于，含有以下的組成(a)包含合成肽和脂質(zhì)的AD載體，所述合成肽包含KnLm的氨基酸序列，其中，n為4-8，m為11-20；(b)羧基乙烯基聚合物；及(c)抗原蛋白，所述抗原蛋白為單獨(dú)不會(huì)產(chǎn)生引起有效的免疫誘導(dǎo)和感染防御效果的量的粘膜免疫IgA及血中免疫IgG的量，所述粘膜疫苗產(chǎn)生引起有效的免疫誘導(dǎo)和感染防御效果的量的抗原特異性粘膜免疫IgA及血中免疫IgG。本發(fā)明的粘膜疫苗與現(xiàn)有的粘膜疫苗相比，具有更強(qiáng)的抗體產(chǎn)生能力，作為其結(jié)果，能夠以極少量的抗原發(fā)揮優(yōu)異的效果。
文檔編號(hào)A61K39/00GK103002908SQ20118001181
公開日2013年3月27日 申請(qǐng)日期2011年3月1日 優(yōu)先權(quán)日2010年3月2日
發(fā)明者木戶博, 水野大 申請(qǐng)人:國(guó)立大學(xué)法人德島大學(xué)