專利名稱：人工抗原的制備——半抗原與蛋白質(zhì)交聯(lián)的新方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及利用新型的橋結(jié)構(gòu)L-賴氨酸或多肽及新型有機(jī)磷縮合試劑將有機(jī)磷化合物半抗原與載體分子(蛋白質(zhì))交聯(lián)的制備人工抗原的方法，屬生物有機(jī)大分子的制備技術(shù)領(lǐng)域。
在化學(xué)免疫及有關(guān)研究領(lǐng)域中為使無免疫原性的小分子物質(zhì)(通常稱為半抗原，Hapten)能在動物體內(nèi)誘發(fā)產(chǎn)生抗體，常要將這種半抗原與某種大分子載體如蛋白質(zhì)、多肽、或多糖等經(jīng)化學(xué)交聯(lián)共價(jià)結(jié)合而成為人工抗原。將人工抗原作為免疫原注射到動物體內(nèi)會誘發(fā)產(chǎn)生抗體。這種抗體經(jīng)過提純后做為疫苗注入人體或動物體后，即可抗某種藥物或病毒，這種過程叫化學(xué)免疫，它是當(dāng)前醫(yī)學(xué)、藥理及生物工程研究(催化抗體)中最活躍的領(lǐng)域之一?；瘜W(xué)免疫中的關(guān)鍵就是人工抗原的制備，過去關(guān)于此方面的報(bào)導(dǎo)較多，比較成熟的交聯(lián)方法包括重氮化法、戊二醛法、混合酸酐法、二異氰酸酯法、鹵代硝基苯法等，這些方法缺點(diǎn)在于所采用的橋結(jié)構(gòu)(即半抗原與蛋白質(zhì)的聯(lián)結(jié)部分)均為人工合成的有機(jī)物，有些化合物的結(jié)構(gòu)還會對誘發(fā)抗體的產(chǎn)生有一定的影響。近來又發(fā)現(xiàn)了一些用多肽做為橋結(jié)構(gòu)進(jìn)行聯(lián)接，但所采用的方法比較陳舊，選擇的催合劑付產(chǎn)物多，難純化，方法掌握也比較困難，特別是對于將含磷化合物的半抗原交聯(lián)到載體分子上，一直是目前在人工抗原制備領(lǐng)域的一個(gè)難點(diǎn)。過去的方法多采用重氮化法，最近也有關(guān)于用His-Cys做橋結(jié)構(gòu)的報(bào)導(dǎo)，但國內(nèi)有些單位重復(fù)實(shí)驗(yàn)一直未能成功。
將半抗原上的羧基與蛋白質(zhì)上的側(cè)鏈氨基交聯(lián)制備抗原的方法是一種常見的方法，但過去采用的一種是用水溶性脫水劑(EDC)，此方法選擇性差，易形成蛋白分子之間的交聚?，F(xiàn)逐漸為活潑酯法所代替?；顫婖シň褪窍葘Ⅳ然cN-羥基琥酰亞胺縮合制成活潑酯，再與蛋白質(zhì)分子交聯(lián)。過去多用二環(huán)已基碳酰亞胺(DCC)做為脫水劑，由于生成的付產(chǎn)物DCU很難除去，影響了活化酯的純度及進(jìn)一步與蛋白質(zhì)的交聯(lián)。
本發(fā)明的目的就是尋找一個(gè)適當(dāng)?shù)臉蚪Y(jié)構(gòu)，并選擇一條簡便、實(shí)用、易操作、產(chǎn)率高、純度好的新型人工半抗原的制備路線，使之適合各類含磷化合物半抗原與載體分子的交聯(lián)。
本發(fā)明的內(nèi)容包括1.選擇了天然有機(jī)物L(fēng)-賴氨酸做為橋結(jié)構(gòu)。由于它存在于所有生物體內(nèi)，從而克服了一些人工合成化合物的引入帶來的不利影響，它適合各類有機(jī)磷半抗原與載體分子的聯(lián)接，也可用于其它有機(jī)物半抗原與載體的交聯(lián)。
2.設(shè)計(jì)了新型的人工抗原的結(jié)構(gòu)模型，這種模型不僅制備容易，而且具有很強(qiáng)的誘發(fā)產(chǎn)生抗體的能力。
3.選擇了一種新型有機(jī)磷的縮合劑如EDCP、DECP、DEPH等及縮合方法及合成路線。
人工抗原的合成路線如下
其中X＝烷氧基、烷基、芳香基等Y＝烷氧基、氰基、胺基、羧基、氧負(fù)離子等Z＝H、Cl、Br、F。
HOSu＝N-羥基琥珀酰亞胺制備通法一、化合物C的制備首先將L-賴氨酸或多肽b溶解于水～乙醇(二者體積比為1∶1)的溶液中，再加入與L-賴氨酸或多肽b成摩爾比為1∶2-3的三乙胺，冷卻至0℃～-5℃。然后將有機(jī)磷化合物的半抗源a溶解于有機(jī)溶劑如四氯化碳、二氯甲烷、氯仿、四氯呋喃、二氧六環(huán)等溶劑中，將該混合溶劑慢慢滴加到上述混合液中，反應(yīng)2～12小時(shí)后，用濃度為1N的無機(jī)酸酸化到PH＝3。最后用乙酸乙酯或乙酸乙酯-叔丁醇萃取，干燥，減壓濃縮，即得到產(chǎn)物C。
二、活潑酯d的制備將上述濃縮物C溶于干燥的乙酸乙酯，或四氯呋喃或二氧六環(huán)中，加入與濃縮物C等摩爾的N-羥基琥珀酰亞胺(HOSu)，再加入稍過量的三乙胺，冰水冷卻下加入縮合劑，縮合劑可為0-乙基二氯磷酸酯(EDCP)，或0.0-二乙基氯磷酸酯(DECP)或二乙基亞磷酯(DEPH)。反應(yīng)5-12小時(shí)后，溶液用弱堿水洗幾次后干燥，即得到活潑酯d。
三、人工抗原e的制備(即半抗原與蛋白質(zhì)的交聯(lián))將蛋白質(zhì)(或酶、糖)溶于水和二甲基甲酰胺(DMF)的溶液中，再加入與蛋白質(zhì)(或酶、糖)等摩爾的三乙胺。加入由上述第二步制得的活潑酯d，在0℃～-10℃反應(yīng)過夜，溶液在蒸餾水中于4℃下透析3天，每天換三次水，冷凍干燥，得到固體e人工抗原。
本方法可在水體系中直接將半抗原含磷化合物a與橋結(jié)構(gòu)化合物b聯(lián)接。半抗原可以為各種結(jié)構(gòu)的含磷化合物。
實(shí)例二異丙基亞磷酸酯即DIP及沙林的人工抗原的制備1.Na、Ne-二(二異丙基磷?；?L-賴氨酸20mmol(2.92g)L-賴氨酸溶于5ml水，5ml乙醇及8ml三乙胺中，冷至0℃，加入二異丙基亞磷酸酯(DIP，40mmol，6.6g)及5ml四氯化碳，反應(yīng)2-1小時(shí)，除去有機(jī)溶劑，水層酸化至PH＝3，用乙酸乙酯萃取，干燥，酸化后除去溶劑即得到無色油狀物，重5.2g，產(chǎn)率55%。
結(jié)構(gòu)測定分子式C18H40N2P2O831P-NMR(EtOAc) 8.26ppm，6.53ppm1H-NMR(CDC13) δ1.0-1.5(m，30H)，2.8-2.9(brs，2H)，3.0-3.3(bs，2H)3.6-3.8(s，1H)，4.3-4.6(m，4H)，11.5(s，1H)FAB-MS m/e MH+475元素分析實(shí)測值 C 45.88， H 8.38， N 5.85計(jì)算值 C 45.56， H 8.44， N 5.912.Na、Ne-二(二異丙基磷?；?L-賴氨酸 N-羥基琥珀酰亞胺酯將磷?；嚢彼?3.0mmol，1.4g)溶于乙酸乙酯中，加入N-羥基琥珀酰亞胺(3.2mmol，0.4g)，常溫下加入4ml三乙胺，冷至0℃，滴加0.5g(3.0mmol)EDCP，反應(yīng)6小時(shí)，溶液用飽和碳酸氫鈉水溶液洗5次(10ml×5)，再用水洗2次(10ml×2)，有機(jī)相用無水硫酸鎂干燥，減壓除去溶劑得到淺黃色油狀物，重1.0g，產(chǎn)率58%。
結(jié)構(gòu)測定分子式C22H43N3P2O1031P-NMR(EtOAc) 8.91ppm，6.24ppm1H-NMR(CDC13) δ1.1-1.3(m，30H)，2.0(s，4H) 2.8-2.9(brs，2H)，3.0-3.3(bs，2H)，3.6-3.8(s，1H)，4.3-4.6(m，4H)。
FAB-MS m/e MH+5723.磷酰化賴氨酸與牛血清白蛋白(BSA)的交聯(lián)(DIP-BSA人工抗原)將牛血清白蛋白(BSA，0.3g)溶于8ml水，4ml二甲基甲酰胺(DMF)及4ml三乙胺中，在0-4℃滴加磷酰化賴氨酸N-羧基琥珀酰亞胺酯(0.8g)的5mlDMF，慢慢攪拌16個(gè)小時(shí)，將溶液裝入透析袋中，將入2升蒸餾水中在4℃下透析三天，每天換三次蒸餾水，透析完畢，冷凍干燥，得到固體蛋白(0.3)，于-20℃冷凍保存。
31P-NMR(H20) 10.3ppm，8.2ppm4.磷?；嚢彼崤c血蘭蛋白(KLH)的交聯(lián)(DIP-KLH人工抗原)方法同上，得到淺蘭色蛋白，低溫保存。
a1P-NMR(H20) 10.0ppm，8.2ppm化學(xué)免疫實(shí)驗(yàn)1.免疫過程將人工抗原DIP-KLH分別溶于0.9%的氯化鈉水及福氏佐劑(FCA or FIA)中，然后等體積混合乳化后備用。
將體重在2.5-3.0Kg的同姓別的新西蘭白兔籠養(yǎng)一段時(shí)間后，進(jìn)行五次免疫，第一次在第一天進(jìn)行，按20mg/Kg體重注射DIP-KLH抗原的FCA乳化液，10天后，進(jìn)行第二次免疫，從白兔的后腳掌注射0.4mlFIA乳化液(含0.2mgDIP-KLH)，然后每間隔一個(gè)月進(jìn)行第三和第四免疫注射，500微克DIP-KLH的1mlFIA。一個(gè)月后，經(jīng)過耳靜脈血管放血及滴定度測定，再進(jìn)行最后一次免疫，從耳部注射2mgDIP-KLH的0.2ml 0.9%NaCl溶液。7天后放血，高速離心除去紅細(xì)胞，收集血清，冷凍備用。
2.抗體純化將兔血清用33%硫酸胺兩次沉淀后得到免疫球蛋白，用0.01mol/L磷酸緩沖液(PH 7.2)透析，剩下的抗體再用蒸餾水透析，用0.22μm膜過濾滅菌后，冷凍干燥，在-20℃保存。
酶的免疫分析將DIP-BSA用0.05mol/L碳酸緩沖液(PH 9.6)稀釋到蛋白濃度為10.0μg/ml，準(zhǔn)備一個(gè)96槽的聚苯乙烯微升板，每槽加入200μl上述溶液，然后在4℃放置過夜，接著用PBS-Tween洗三次，(PBS 10mml/L，0.05%Tween-20，PH 7.2)首先測定抗血清滴度，將一系列不同濃度的血清樣品各取100μl加入到裝有DIP-BSA的小槽中，37℃保溫1小時(shí)，用PBS-Tween洗三次，三十分鐘后，加入100μl稀釋千分之一的GAR-HRP(免疫球蛋白的辣根過氧化物酶輔劑)后再加入100μl四甲基聯(lián)苯胺(TMB)的底物溶液(100μlTMB及15μl30%過氧化氫，溶于10μl磷酸緩沖液，0.1ml/L，PH 6.0)，在室溫下暗處反應(yīng)30分鐘，再加入50μl20μl/L的硫酸，在450nm處測定每個(gè)原子的吸光度，抗體的滴度可用血清的稀釋率與50%最高吸光度值的對應(yīng)關(guān)系標(biāo)定出來，并可進(jìn)一步用競爭性抑制酶的免疫分析。
類似方法可以測定亞磷酸二異丙酯(DIP)和沙林(一種很強(qiáng)的膽堿酯酶抑制劑，用于化學(xué)戰(zhàn)劑)的抑制率，對DIP和沙林的最低檢出濃度分別為10-6和10-5摩爾每升。
權(quán)利要求
1.一種新人工抗原的制備方法，其特征在于該制備方法采用如下合成路線 其中X=烷氧基、烷基、芳香基等Y=烷氧基、氰基、胺基、羧基、氧負(fù)離子等Z=H、Cl、Br、F。HOSu=N-羥基琥珀酰亞胺制備通法一、化合物C的制備首先將L-賴氨酸或多肽b溶解于水～乙醇(二者體積比為1∶1)的溶液中，再加入與L-賴氨酸或多肽b成摩爾比為1∶2-3的三乙胺，冷卻至0℃～5℃。然后將有機(jī)磷化合物的半抗源a溶解于有機(jī)溶劑如四氯化碳、二氯甲烷、氯仿、四氯呋喃、二氧六環(huán)等溶劑中，將該混合溶劑慢慢滴加到上述混合液中，反應(yīng)2～12小時(shí)后，用濃度為1N的無機(jī)酸酸化到PH=3。最后用乙酸乙酯或乙酸乙酯-叔丁醇萃取，干燥，減壓濃縮，即得到產(chǎn)物C。二、活潑酯d的制備將上述濃縮物C溶于干燥的乙酸乙酯，或四氯呋喃或二氧六環(huán)中，加入與濃縮物C等摩爾的N-羥基琥珀酰亞胺(HOSu)，再加入稍過量的三乙胺，冰水冷卻下加入縮合劑，縮合劑可為0-乙基二氯磷酸酯(EDCP)，或0.0-二乙基氯磷酸酯(DECP)或二乙基亞磷酯(DEPH)。反應(yīng)5-12小時(shí)后，溶液用弱堿水洗幾次后干燥，即得到活潑酯d。三、人工抗原e的制備(即半抗原與蛋白質(zhì)的交聯(lián))將蛋白質(zhì)(或酶、糖)溶于水和二甲基甲酰胺(DMF)的溶液中，再加入與蛋白質(zhì)(或酶、糖)等摩爾的三乙胺。加入由上述第二步制得的活潑酯d，在0℃～-10℃反應(yīng)過夜，溶液在蒸餾水中于4℃下透析3天，每天換三次水，冷凍干燥，得到固體e人工抗原。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種新型的人工抗原的合成方法，將半抗原(主要是指含磷化合物)先鍵合在L-賴氨酸或多肽上制成磷?；嚢彼峄蚨嚯乃幔儆每s合試劑EDCP與N-羧基琥珀酰亞胺反應(yīng)制備出活化酯，最后在水體系中與蛋白質(zhì)載體交聯(lián)，此方法操作簡便，易于掌握，收率較高，適合于含磷化合物半抗原與蛋白質(zhì)的交聯(lián)，也可推廣到其它類型半抗原的交聯(lián)。
文檔編號A61K39/385GK1104216SQ9410504
公開日1995年6月28日 申請日期1994年5月13日 優(yōu)先權(quán)日1994年5月13日
發(fā)明者趙玉芬, 閻慶金 申請人:清華大學(xué)