專利名稱：用于預(yù)防、穩(wěn)定和/或抑制病理性新生血管形成相關(guān)病癥的可注射用藥物組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及尤其是眼科領(lǐng)域的病理性新生血管形成相關(guān)病癥的治療。具體而言，本發(fā)明涉及包含能夠抑制胰島素受體底物I (IRS-1)表達(dá)的反義寡核苷酸GS-101的可注射用藥物組合物，以預(yù)防和/或治療眼的病理性新生血管形成相關(guān)病癥。
背景技術(shù)：
血管生成是新血管通過其形成的基本過程。該過程在多種正常生理現(xiàn)象例如生殖、發(fā)育、甚至傷口愈合中是必不可少的。內(nèi)皮細(xì)胞的新生血管形成包括內(nèi)皮細(xì)胞的遷移、生長和分化。這些生物現(xiàn)象的調(diào)節(jié)與胰島素受體底物I(IRS-1)相關(guān)，胰島素受體底物I是細(xì)胞質(zhì)?？康鞍?，其發(fā)揮活化的細(xì)胞表面受體(包括胰島素、胰島素樣生長因子I (IGF-1)、催乳素、生長激素(GH)、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)受體，整合素受體家族成員)的下游的必需信號傳導(dǎo)中間體的作用，并選擇細(xì)胞因子受體。盡管新生血管形成可能是正常的生理過程，但是病理性新生血管形成在許多疾病中尤其是在眼科中是關(guān)鍵的情況。在眼科中，眼后段的病變特別是視網(wǎng)膜病變是現(xiàn)代社會更多致殘病變中的一些。這些病變中的許多以視網(wǎng)膜、虹膜和脈絡(luò)膜異常新生血管形成，隨之形成功能失調(diào)的新生血管(其可能導(dǎo)致滲漏或出血或可能與導(dǎo)致視力下降的視網(wǎng)膜水腫、視網(wǎng)膜/玻璃體出血或視網(wǎng)膜脫離有關(guān))為特征(Survey of Ophthalmology, Jan.2007, Vol.52, SI, S3-S19)。眼部病理性新生血管還已知為人類失明的主要原因之一，并在不同的眼部疾病中發(fā)現(xiàn)(Bradley等,2007, AngiogenesislO:141-8;Chen和 Smith, 2007, AngiogenesislO:133-40;Friedlander 等,2007, AngiogenesislO:89-101)。目前正在實施用于治療眼后段疾病如葡萄膜炎、黃斑變性、黃斑水腫等的療法中，玻璃體內(nèi)注射皮質(zhì)類固醇是之一。然而，皮質(zhì)類固醇具有眾所周知的缺點，仍然需要新的用于治療與病理性新生血管形成相關(guān)的眼睛內(nèi)部紊亂、病癥或疾病的療法。本發(fā)明帶來解決方案:現(xiàn)在發(fā)現(xiàn)稱為GS-101的特異性寡核苷酸，已知在局部給藥中其抑制 IRS-1 基因表達(dá)的能力(例如 EP1409672，Bock 等，Ophthalmologe, 2007, 104:336-44;Al-Mahmood 等，The journal of pharmacology and experimental therapeutics, 2
009,329:496-504; Cursiefen 等,Ophthalmology, 2009, 116 (9): 1630-7),當(dāng)眼內(nèi)給藥用于治療與病理性新生血管形成相關(guān)的眼睛內(nèi)部的病變時是特別使人感興趣的。這是令人驚奇的，因為體外GS-101對內(nèi)皮細(xì)胞的效果在24小時溫育后是最大的且是暫時的。根據(jù)這些結(jié)果，當(dāng)在眼后段內(nèi)給藥時GS-101，沒有預(yù)期長期效果。 眼內(nèi)途徑帶來了使給予患者治療有效但低量的活性成分成為可能的進(jìn)一步優(yōu)點。其還有控制精確的給藥量以及避免任何患者引起的對治療不遵從的進(jìn)一步優(yōu)點。

發(fā)明內(nèi)容
因此，本發(fā)明涉及用于治療和/或預(yù)防眼睛內(nèi)部的至少一種病理性新生血管形成相關(guān)病癥的藥物組合物，所述組合物包含治療有效量的具有以下序列SEQ ID NO:1的反義寡核苷酸， 5 ’ -TCTCCGGAGGGCTCGCCATGCTGCT-3，或具有包含9至30個核苷酸的任何功能保守序列的反義寡核苷酸，所述功能保守序列與 SEQ ID NO:1 相比具有 75%、80%、85%、90%、95%或大于 95%、96%、97%、98%、99% 的同一性且保留如SEQ ID NO:1的抑制IRS-1基因表達(dá)能力，并且所述組合物通過在眼后段內(nèi)給藥來施用給需要其的個體。在本發(fā)明的一個實施方案中，SEQ ID NO:1的功能保守序列是5’ -TATCCGGAGGGCTCGCCATGCTGCT-3’ (SEQ ID NO:2)。在本發(fā)明的一個 實施方案中，SEQ ID NO:1的功能保守序列選自以下組成的組:5’-TCTCCGGAGGGCTCGCCATGCTGC-3’ (SEQ ID NO:3)5’-TCTCCGGAGGGCTCGCCATGCTG-3’ (SEQ ID NO:4)5，-TCTCCGGAGGGCTCGCCATGCT-3’ (SEQ ID NO:5)5’-TCTCCGGAGGGCTCGCCATGC-3’ (SEQ ID NO:6)5，-TCTCCGGAGGGCTCGCCATG-3’ (SEQ ID NO:7)5’-TCTCCGGAGGGCTCGCCAT-3’ (SEQ ID NO:8)5’-CTCCGGAGGGCTCGCCATGCTGCT-3’ (SEQ ID NO:9)5，-TCCGGAGGGCTCGCCATGCTGCT-3，(SEQ ID NO: 10)5，-CCGGAGGGCTCGCCATGCTGCT-3，(SEQ ID NO: 11)5，-CGGAGGGCTCGCCATGCTGCT-3，(SEQ ID NO: 12)5，-GGAGGGCTCGCCATGCTGCT-3，(SEQ ID NO: 13)5，-GAGGGCTCGCCATGCTGCT-3，(SEQ ID NO: 14)5，-AGGGCTCGCCATGCTGCT-3，(SEQ ID NO: 15)5，-GGCTCGCCATGCTGCT-3，(SEQ ID NO: 16)5，-GCTCGCCATGCTGCT-3，(SEQ ID NO: 17)5，-CTCGCCATGCTGCT-3，(SEQ ID NO: 18)5，-TCGCCATGCTGCT-3，(SEQ ID NO: 19)5，-CGCCATGCTGCT-3，(SEQ ID NO:20)。在本發(fā)明的一個實施方案中，包含在本發(fā)明的藥物組合物中的寡核苷酸的濃度為約 0.01mg/ml 至約 100mg/ml。在本發(fā)明的一個實施方案中，每次給藥注射的組合物體積范圍為I至500 μ I。在本發(fā)明的一個實施方案中，眼后段內(nèi)給藥是玻璃體內(nèi)注射。在本發(fā)明的一個實施方案中，如上文所述的組合物注射至多每周一次，優(yōu)選每兩周一次，更優(yōu)選每三周一次，甚至更優(yōu)選一個月一次，還甚至更優(yōu)選每兩個月一次。在本發(fā)明的一個實施方案中，所述組合物以單位劑量的形式包裝，優(yōu)選所述單位劑量是一次性注射器。有利地，所述組合物是無菌的。
根據(jù)本發(fā)明的實施方案，病理性新生血管形成相關(guān)的病癥可以是葡萄膜炎、脈絡(luò)膜炎、視網(wǎng)膜脈絡(luò)膜炎、脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜炎、視網(wǎng)膜變性、AMD、視網(wǎng)膜脫離、視網(wǎng)膜新生血管形成、增生性玻璃體視網(wǎng)膜病變、早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變(ROP)、糖尿病視網(wǎng)膜病變、后段創(chuàng)傷、視網(wǎng)膜血管病變、眼內(nèi)炎、黃斑水腫、視網(wǎng)膜炎癥性病變、影響視網(wǎng)膜的全身性病變。
具體實施例方式因此，本發(fā)明涉及用于治療眼睛內(nèi)部的與病理性新生血管形成相關(guān)的眼部疾病的或用于在所述治療中使用的藥物組合物，其中所述組合物包含治療有效量的GS-101且所述組合物通過眼內(nèi)途徑給予需要其的個體。在本發(fā)明的一個實施方案中，所述眼內(nèi)途徑指眼睛內(nèi)部給藥，優(yōu)選眼后段內(nèi)給藥，更優(yōu)選玻璃體內(nèi)給藥。優(yōu)選地，所述給藥是注射。在一個實施方案中，由本發(fā)明的組合物治療的眼部疾病是與病理性視網(wǎng)膜血管形成相關(guān)的視網(wǎng)膜疾病。根據(jù)本發(fā)明，所述組合物配制成適合于眼內(nèi)注射的形式。根據(jù)第一個實施方案，所述組合物是水溶液。水溶液的實例包括但不限于GS-101在NaCl中的溶液，優(yōu)選在0.9%NaCl中。根據(jù)第二個實施方案，所述組合物在植入物內(nèi)。根據(jù)第三個實施方案，所述組合物與持續(xù)遞送系統(tǒng)、組合物或裝置聯(lián)合。根據(jù)第四個實施方案，所述組合物可包含GSlOl和聚合劑。根據(jù)本發(fā)明，GS-101是具有以下序列SEQ ID NO:1的反義寡核苷酸，5，-TCTCCGGAGGGCTCGCCATGCTGCT-3，或具有包含9至30個核苷酸的任何功能保守序列的反義寡核苷酸，所述功能保守序列與 SEQ ID NO:1 相比具有 75%、80%、85%、90%、95%或大于 95%、96%、97%、98%、99% 的同一性且保留如SEQ ID NO:1的抑制病理性新生血管形成能力。術(shù)語“同一性” 或“相同的”，當(dāng)用于兩個或多個核苷酸序列的序列之間的關(guān)系時，指核苷酸序列之間的序列關(guān)聯(lián)的程度，由兩個或更多個堿基串之間的匹配數(shù)所確定?！巴恍浴睖y量兩個或多個序列的較小者之間的相同匹配的百分比，由特定的數(shù)學(xué)模型或計算機(jī)程序(即“算法”)處理空位比對(如果有的話)。相關(guān)核苷酸序列的同一性可以容易地通過已知的方法計算。這些方法包括但不限于Computational Molecular Biology, Lesk, A.M.編著,Oxford University Press,紐約,1988;Biocomputing:1nformatics andGenome Projects, Smith, D.ff.編著，Academic Press,紐約，1993; Computer Analysisof Sequence Data,第 I 部分，Griffin, A.M.和 Griffin, H.G.編著,Humana Press,新澤西，1994;Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., AcademicPress, 1987; Sequence Analysis Primer, Gribskov, M.和 Devereux, J.編著，M.StocktonPress,紐約，1991;以及 Carillo 等，SIAM J.Applied Math.48, 1073(1988)。用于確定同一性的優(yōu)選方法設(shè)計為給出測試序列之間的最大匹配。在公眾可獲得的計算機(jī)程序中描述確定同一性的方法。用于確定兩個序列之間同一性的優(yōu)選計算機(jī)程序方法包括GCG程序包，包括 GAP ((Devereux 等，Nucl.Acid.Res.\2, 387 (1984) ; Genetics Computer Group,威斯康星大學(xué)，麥迪遜，威斯康星州)、BLASTP、BLASTN和FASTA (Altschul等，J.Mo1.Biol.215，403-410 (1990))。BLASTX程序從國家生物技術(shù)信息中心(NCBI)以及其他來源(BLAST Manual, Altschul 等，NCB/NLM/NIH Bethesda, Md.20894; Altschul 等，同前)可公眾獲得。眾所周知的Smith Waterman算法也可用來確定同一'丨生。SEQ ID NO:1 的功能保守序列的實例是SEQ ID NO: 2 (5，-TATCCGGAGGGCTCGCCATGCTGCT-3’)。SEQ ID NO:1的功能保守序列的其它實例是以下序列:5，-TCTCCGGAGGGCTCGCCATGCTGC-3’ (SEQ ID NO:3)5，-TCTCCGGAGGGCTCGCCATGCTG-3，(SEQ ID NO:4)5’-TCTCCGGAGGGCTCGCCATGCT-3’ (SEQ ID NO:5)5’-TCTCCGGAGGGCTCGCCATGC-3’ (SEQ ID NO:6)5，-TCTCCGGAGGGCTCGCCATG-3’ (SEQ ID NO:7)5，-TCTCCGGAGG GCTCGCCAT-3，(SEQ ID NO:8)5’-CTCCGGAGGGCTCGCCATGCTGCT-3’ (SEQ ID NO:9)5，-TCCGGAGGGCTCGCCATGCTGCT-3，(SEQ ID NO: 10)5，-CCGGAGGGCTCGCCATGCTGCT-3，(SEQ ID NO: 11)5，-CGGAGGGCTCGCCATGCTGCT-3，(SEQ ID NO: 12)5，-GGAGGGCTCGCCATGCTGCT-3，(SEQ ID NO: 13)5，-GAGGGCTCGCCATGCTGCT-3，(SEQ ID NO: 14)5，-AGGGCTCGCCATGCTGCT-3，(SEQ ID NO: 15)5，-GGCTCGCCATGCTGCT-3，(SEQ ID NO: 16)5，-GCTCGCCATGCTGCT-3，(SEQ ID NO: 17)5，-CTCGCCATGCTGCT-3，(SEQ ID NO: 18)5，-TCGCCATGCTGCT-3，(SEQ ID NO: 19)5，-CGCCATGCTGCT-3，(SEQ ID NO:20)根據(jù)一個實施方案，所述包含9至30個核苷酸的功能保守序列可以是在C-末端和N-末端中的其他核酸之間包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO: 2的序列。所述功能保守序列還可以是SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的9至12個連續(xù)核苷酸片段。所述藥物組合物可以包含如上所述的GS-101或如上所述的其功能保守序列與用于眼內(nèi)途徑的任何藥學(xué)上可接受的賦形劑聯(lián)合。在本發(fā)明的一個實施方案中，所述眼內(nèi)途徑是眼睛內(nèi)部內(nèi)給藥，優(yōu)選眼后段內(nèi)給藥，更優(yōu)選玻璃體內(nèi)給藥。優(yōu)選地，所述給藥是玻璃體內(nèi)注射。本發(fā)明還涉及用于治療有需要的個體中眼睛內(nèi)部的病理性新生血管形成相關(guān)病癥的方法，該方法包括給予所述個體治療有效量的、包含如上所述的GS-101或如上所述的其功能保守序列的、與藥學(xué)上可接受的賦形劑聯(lián)合的組合物，所述組合物通過眼內(nèi)途徑施用。在本發(fā)明的一個實施方案中，所述眼內(nèi)途徑是眼睛內(nèi)部內(nèi)給藥，優(yōu)選眼后段內(nèi)給藥，更優(yōu)選玻璃體內(nèi)給藥。優(yōu)選地，所述給藥是玻璃體內(nèi)注射。在一個實施方案中，所述眼睛內(nèi)部的病理性新生血管形成相關(guān)病癥選自葡萄膜炎、脈絡(luò)膜炎、視網(wǎng)膜脈絡(luò)膜炎、脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜炎、視網(wǎng)膜變性、AMD、視網(wǎng)膜脫離、視網(wǎng)膜新生血管形成、增生性玻璃體視網(wǎng)膜病變、早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變(ROP)、糖尿病視網(wǎng)膜病變、后段創(chuàng)傷、視網(wǎng)膜血管病變、眼內(nèi)炎、黃斑水腫、視網(wǎng)膜炎癥性病變和影響視網(wǎng)膜的全身性病變。根據(jù)一個實施方案，如上所述的GS-101或其功能保守序列以約0.01mg/ml至約100mg/ml,優(yōu)選0.lmg/ml至80mg/ml,更優(yōu)選6至60mg/ml,甚至更優(yōu)選約8至約12mg/ml的濃度存在于本發(fā)明的組合物中。根據(jù)一個實施方案，每次給藥所述注射的組合物的體積范圍在I至500 μ 1，優(yōu)選在約5至400 μ 1，更優(yōu)選在5至300 μ I。根據(jù)一個實施方案，所述注射的組合物的體積為約 50 μ I。根據(jù)一個實施方案，每次給藥注射的GS-101的量范圍在10至5000 μ g，優(yōu)選在約50至4000 μ g，更優(yōu)選在50至3000 μ g。根據(jù)一個實施方案，注射的GS-101的量為約500 μ g0在一個實施方案中，所述藥物組合物是這樣的，使得所述眼內(nèi)給藥是玻璃體內(nèi)給藥。根據(jù)一個實施方案，所述組合物注射至多每三周一次，優(yōu)選至多每四周一次，甚至更優(yōu)選每八周一次。如實施例中所證明的，本發(fā)明的組合物以至多每三周注射一次獲得最佳的治療。該結(jié)果是令人驚奇的，因為當(dāng)內(nèi)皮細(xì)胞體外用GS-101溫育時，效果在溫育后24小時是最大的且僅是暫時的。根據(jù)一個實施方案，所述患者在二至五個月，優(yōu)選三個月期間每三周注射一次，優(yōu)選每四周注射一次治療。根據(jù)一個實施方案，治療期間是三至六個月。如果在患者中觀察到視敏度損失，則可以重新進(jìn)行所述治療。在本發(fā)明的一個實施方案中，如上所述的藥物組合物以單位劑量的形式包裝。在另一個實施方案中，所述單位劑量是一次性注射器。優(yōu)選地，所述單位劑量是無菌的。定義根據(jù)本發(fā)明，下列術(shù)語具有以下含義:“約”指所限定的數(shù)值、參數(shù)或特征加上或減去10%。“眼睛內(nèi)部”指位于眼球內(nèi)的任何部位，包括眼睛的前和后段，其通常包括但并不限于眼球內(nèi)存在的任何功能性(例如視覺)或結(jié)構(gòu)性組織，或者部分或完全地襯于眼球內(nèi)部的組織或細(xì)胞層。部位的具體實例包括前房、后房、玻璃體腔、脈絡(luò)膜、黃斑和視網(wǎng)膜以及使后眼部區(qū)域或位點血管形成或受神經(jīng)支配的血管和神經(jīng)。根據(jù)優(yōu)選的實施方案，眼睛內(nèi)部指眼后段，包括后房、玻璃體腔、脈絡(luò)膜、黃斑和視網(wǎng)膜以及使后眼部區(qū)域或位點血管形成或受神經(jīng)支配的血管和神經(jīng)。優(yōu)選地，表述“眼睛內(nèi)部的疾病”指視網(wǎng)膜和/或脈絡(luò)膜和/或黃斑和/或后房的疾病?！芭c病理性新生血管形成相關(guān)的病癥”或“病理性新生血管形成相關(guān)病癥”是其中存在不期望的新生血管形成的疾病，包括以下疾病:葡萄膜炎、脈絡(luò)膜炎、視網(wǎng)膜脈絡(luò)膜炎、脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜炎、視網(wǎng)膜變性、AMD、視網(wǎng)膜脫離、視網(wǎng)膜新生血管形成、增生性玻璃體視網(wǎng)膜病變、早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變(ROP)、糖尿病視網(wǎng)膜病變、后段創(chuàng)傷、視網(wǎng)膜血管病變、眼內(nèi)炎、黃斑水腫、視網(wǎng)膜炎癥性病變、影響視網(wǎng)膜的全身性病變，可能與用于治療該相同病變的其他療法組合。特別地，本發(fā)明的目的是解決血液和淋巴新生血管形成?！爸委熂膊　敝阜乐?即阻止 發(fā)生)、降低或減輕與器官、組織或細(xì)胞功能缺陷或喪失相關(guān)的疾病、紊亂或病癥中的至少一種不良效應(yīng)或癥狀。
“治療有效量”指旨在以下而對目標(biāo)不引起顯著的負(fù)性或不良作用的藥劑的水平或量:(1)延遲或預(yù)防與病理性新生血管形成相關(guān)的疾病、紊亂或病癥的發(fā)生；(2)減慢或停止與病理性新生血管形成相關(guān)的疾病、紊亂或病癥的一個或多個癥狀的發(fā)展、加重或惡化；(3)使得與病理性新生血管形成相關(guān)的疾病、紊亂或病癥的癥狀改善；(4)降低與病理性新生血管形成相關(guān)的疾病、紊亂或病癥的嚴(yán)重程度或發(fā)生率；(5)治愈與病理性新生血管形成相關(guān)的疾病、紊亂或病癥。治療有效量可以在與病理性新生血管形成相關(guān)的疾病、紊亂或病癥發(fā)生之前施用用于預(yù)防或防止作用。可替代地或額外地，所述治療有效量可以在與病理性新生血管形成相關(guān)的疾病、紊亂或病癥發(fā)生之后施用用于治療作用。在一個實施方案中，所述目標(biāo)是眼睛內(nèi)部，在該實施方案中，GS-101的治療有效量是有效減輕眼睛內(nèi)部的病理性新生血管形成相關(guān)病癥的至少一種癥狀的量?！把蹆?nèi)”指眼內(nèi)給藥途徑。在一個實施方案中，眼內(nèi)給藥途徑是眼睛內(nèi)部內(nèi)的給藥，優(yōu)選眼后段內(nèi)，更優(yōu)選玻璃體內(nèi)。優(yōu)選眼內(nèi)途徑是玻璃體內(nèi)注射。根據(jù)本發(fā)明，眼內(nèi)途徑是特別令人感興趣的，因為其使得使用相當(dāng)?shù)秃椭委煖?zhǔn)確劑量的活性成分(即GS-101或其功能保守序列)并獲得最佳的治療。事實上，如實施例所證明，本發(fā)明的組合物以最多每三周注射一次獲得最佳治療。該結(jié)果是令人驚奇的，因為當(dāng)細(xì)胞用GS-101溫育時，效果在溫育24小時后是最大的且僅是暫時的?！皞€體”指哺乳動物，優(yōu)選人，但也可以指動物，例如寵物。


圖1是顯示OIR之后GS-101或其載體(NaCl)的兩個眼內(nèi)注射對視網(wǎng)膜新生血管形成的影響的直方圖。結(jié)果是均值土SEM。與載體相比P〈0.01 ；$:與錯義(Scramble)相比P〈0.05。(錯義是與GS-101具有相同堿基但不具有相同序列的寡核苷酸，從其設(shè)計術(shù)語“錯義”)。圖2是顯示激光治療后第22/23日玻璃體內(nèi)注射GS-101對病變晚期熒光信號強(qiáng)度的影響的直方圖。豎線指 示SEM。圖3是顯示用單劑量GS-101 (10 μ M)或錯義寡核苷酸(10 μ Μ)在IRS-1隨時間表達(dá)上對人內(nèi)皮細(xì)胞的治療效果的直方圖。IRS-1蛋白通過ELISA進(jìn)行定量。結(jié)果以對照(用載體溫育的細(xì)胞)的％表示，其代表三次實驗的平均值。豎線指示SEM。ns=未顯示。實施例實施例1實驗方法程序和實驗方案由我們的機(jī)構(gòu)審查委員會批準(zhǔn)，并根據(jù)我們的機(jī)構(gòu)指導(dǎo)方針以及法國和加拿大的實驗室動物護(hù)理和使用指南(Guide for the Care and Use ofLaboratory Animals)進(jìn)行。動物保持在標(biāo)準(zhǔn)條件下，可自由接近食物和水(24°C ; 12:12小時光照/黑暗周期)。大鼠中氧誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜病變?nèi)缰八觯褂醚跽T導(dǎo)的視網(wǎng)膜病變(OIR)大鼠模型(Dorfman A, Dembinska0，Chemtob S，Lachapelle P.Early manifestations of postnatal hyperoxia on theretinal structure and function of the neonatal rat.1nvest Ophthalmol VisSci2008; 49:458-466)。將新生 SD 大鼠幼嵐(Charles River Laboratories, St-Constant,魁北克，加拿大)出生后立即暴露于80%氧氣(醫(yī)用級100%02和用氧儀表測量的室內(nèi)空氣的混合物；MaxO2Ceramatec, 0M25-ME型號，Medicana Inc.,蒙特利爾,魁北克,加拿大)。簡而言之，從出生到出生后第14日每日持續(xù)22.5小時暴露于高氧(80%02)，用常氧條件下(21%02) 30分鐘持續(xù)時間的三次間隔中斷。高氧暴露后，將動物在P14下分配至以下實驗，并將動物在P14和P16下通過在一只眼內(nèi)玻璃體內(nèi)注射僅I μ I載體(無菌NaCl0.9%) (η=8)或含有錯義GS-101寡核苷酸(2mg/ml,遞送2 μ g, n=4)或濃度為0.5mg/ml (遞送0.5 μ g,n=7)、l(遞送lμg，n=8)和2(遞送2μg，n=8)的GS-101(SEQ ID N0:2)的載體進(jìn)行治療。在注射前，將大鼠用氟烷( 2.5%)麻醉，用連接于約60規(guī)格的玻璃毛細(xì)管的10μ IHamilton注射器注射。在治療期間，將大鼠保持在周期光照環(huán)境(801ux; 12小時黑暗/12小時光照)下。最后，將幼崽的母親每24小時在常氧和高氧條件下交替，使得可能避免已知在成年大鼠在高氧環(huán)境下引起的肺部并發(fā)癥。然后將所有動物在P18下安樂處死:摘除眼睛，切開前段，眼杯(eyecup)在4%福爾馬林中固定過夜。上面詳述的劑量基于估計的眼睛體積(出生后第三周 25 μ I vs.成人 50 μ L)。新生大鼠中發(fā)育的視網(wǎng)膜血管形成在氟烷麻醉下，在Pl和Ρ3下將I μ I僅載體(無菌NaCl0.9%) (η=6)或含有濃度為0.5mg/ml的GS-101載體(遞送0.5 μ g，n=8)注射入一只眼睛中。大鼠幼崽眼睛體積是成人的約0.3%。 視網(wǎng)膜鋪片(flatmount)隨后分離視網(wǎng)膜，并制備鋪片用于腺苷二磷酸酶(ADPase)染色。固定標(biāo)本并拍照(40x, Axiophot 顯微鏡，Carl Zeiss Meditec, GmbH, Oberkochen,德國)。對于發(fā)育方案，已經(jīng)使用 ImagePro Plus4.5 (Media Cybernetics, Silver Spring, MD)評價視網(wǎng)膜血管形成面積和強(qiáng)度。對于OIR方案，使用評價以下標(biāo)準(zhǔn)的視網(wǎng)膜評分系統(tǒng)評估視網(wǎng)膜病變的嚴(yán)重程度:血管生長、血管叢、額外的視網(wǎng)膜新生血管形成、中央血管收縮、視網(wǎng)膜出血和血管迂曲。此外，已經(jīng)在視網(wǎng)膜鋪片上評價了血管叢本身。統(tǒng)計分析通過ANOVA使用 Dunnett posttest (GraphPad Software Inc, San Diego, CA, USA)進(jìn)行統(tǒng)計分析。P <0.05認(rèn)為是顯著的。為確定在后房中抑制OIR大鼠視網(wǎng)膜新生血管形成所需要的GS-101的有效濃度，將GS-101注射入眼睛中。如圖1所示，0.5yg劑量降低病理性新生血管形成?？紤]眼睛的體積(25 μ I)，這表明需要20 μ g/ml的濃度降低OIR大鼠模型中的視網(wǎng)膜新生血管形成。結(jié)果表I眼內(nèi)注射GS-101對新生大鼠發(fā)育期間視網(wǎng)膜中正常血管形成及其強(qiáng)度的影響。
權(quán)利要求
1.用于治療和/或預(yù)防眼睛內(nèi)部的至少一種病理性新生血管形成相關(guān)病癥的藥物組合物，所述組合物包含治療有效量的具有以下序列SEQ ID NO:1的反義寡核苷酸，5’ -TCTCCGGAGGGCTCGCCATGCTGCT-3’ 或具有包含9至30個核苷酸的任何功能保守序列的反義寡核苷酸，所述功能保守序列與 SEQ ID NO:1 相比具有 75%、80%、85%、90%、95% 或大于 95%、96%、97%、98%、99% 的同一性且保留如SEQ ID NO:1的抑制IRS-1基因表達(dá)能力，以及所述組合物通過在眼后段內(nèi)施用被施用給需要其的個體。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的用于治療和/或預(yù)防眼睛內(nèi)部的至少一種病理性新生血管形成相關(guān)病癥的藥物組合物，其中所述SEQ ID NO:1的功能保守序列是5’-TATCCGGAGGGCTCGCCATGCTGCT-3， (SEQ ID NO:2)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的用于治療和/或預(yù)防眼睛內(nèi)部的至少一種病理性新生血管形成相關(guān)病癥的藥物組合物，其中所述SEQ ID NO:1的功能保守序列選自以下組成的組:5’ -TCTCCGGAGGGCTCGCCATGCTGC-3’ (SEQ ID NO:3) 5’ -TCTCCGGAGGGCTCGCCATGCTG-3’ (SEQ ID NO:4)5’ -TCTCCGGAGGGCTCGCCATGCT-3’ (SEQ ID NO:5)5’ -TCTCCGGAGGGCTCGCCATGC-3’ (SEQ ID NO:6)5’ -TCTCCGGAGGGCTCGCCATG-3’ (SEQ ID NO:7)5’ -TCTCCGGAGGGCTCGCCAT-3’ (SEQ ID NO:8)5’ -CTCCGGAGGGCTCGCCATGCTGCT-3’ (SEQ ID NO:9)5’ -TCCGGAGGGCTCGCCATGCTGCT-3’ (SEQ ID NO:10)5’ -CCGGAGGGCTCGCCATGCTGCT-3’ (SEQ ID NO:11)5’ -CGGAGGGCTCGCCATGCTGCT-3’ (SEQ ID NO:12)5， -GGAGGGCTCGCCATGCTGCT-3， (SEQ ID NO:13)5， -GAGGGCTCGCCATGCTGCT-3， (SEQ ID NO:14)5’ -AGGGCTCGCCATGCTGCT-3’ (SEQ ID NO:15)5， -GGCTCGCCATGCTGCT-3， (SEQ ID NO:16)5， -GCTCGCCATGCTGCT-3， (SEQ ID NO:17)5， -CTCGCCATGCTGCT-3， (SEQ ID NO:18)5， -TCGCCATGCTGCT-3， (SEQ ID NO:19)5’ -CGCCATGCTGCT-3’ (SEQ ID NO:20)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1至3任一項的用于治療和/或預(yù)防眼睛內(nèi)部的至少一種病理性新生血管形成相關(guān)病癥的藥物組合物，其中所述寡核苷酸的濃度為約0.01mg/ml至約IOOmg/ml ο
5.根據(jù)權(quán)利要求1至4任一項的用于治療和/或預(yù)防眼睛內(nèi)部的至少一種病理性新生血管形成相關(guān)病癥的藥物組合物，其中每次施用所注射的組合物的體積的范圍為I至500 μ I。
6.根據(jù)權(quán)利要求1至5任一項的用于治療和/或預(yù)防眼睛內(nèi)部的至少一種病理性新生血管形成相關(guān)病癥的藥物組合物，其中所述在眼后段內(nèi)施用是玻璃體內(nèi)注射。
7.根據(jù)權(quán)利要求1至6任一項的用于治療和/或預(yù)防眼睛內(nèi)部的至少一種病理性新生血管形成相關(guān)病癥的藥物組合物，其中所述組合物注射至多每周一次，優(yōu)選每兩周一次，更優(yōu)選每三周一次，甚至更優(yōu)選一個月一次，還更優(yōu)選每兩個月一次。
8.根據(jù)權(quán)利要求1至7任一項的用于治療和/或預(yù)防眼睛內(nèi)部的至少一種病理性新生血管形成相關(guān)病癥的藥物組合物，其中所述組合物以單位劑量的形式包裝。
9.根據(jù)權(quán)利要求1至8任一項的用于治療和/或預(yù)防眼睛內(nèi)部的至少一種病理性新生血管形成相關(guān)病癥的藥物組合物，其中所述組合物是無菌的。
10.根據(jù)權(quán)利要求8或權(quán)利要求9的用于治療和/或預(yù)防眼睛內(nèi)部的至少一種病理性新生血管形成相關(guān)病癥的藥物組合物，其中所述單位劑量是一次性注射器。
11.根據(jù)權(quán)利要求1至10任一項的用于治療和/或預(yù)防眼睛內(nèi)部的至少一種病理性新生血管形成相關(guān)病癥的藥物組合物，其中所述病理性新生血管形成相關(guān)病癥可以是葡萄膜炎、脈絡(luò)膜炎、視網(wǎng)膜脈絡(luò)膜炎、脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜炎、視網(wǎng)膜變性、AMD、視網(wǎng)膜脫離、視網(wǎng)膜新生血管形成、增生性玻璃體視網(wǎng)膜病變、早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變(ROP)、糖尿病視網(wǎng)膜病變、后段創(chuàng)傷、視網(wǎng)膜血管病變、眼內(nèi)炎、黃斑水腫、視網(wǎng)膜炎癥性病變、影響視網(wǎng)膜的全身性病變。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于治療和/或預(yù)防眼睛內(nèi)部的至少一種病理性新生血管形成相關(guān)病癥的藥物組合物，所述組合物包含治療有效量的具有以下序列SEQ ID NO:1的反義寡核苷酸，5’-TCTCCGGAGGGCTCGCCATGCTGCT-3’或具有包含9至30個核苷酸的任何功能保守序列的反義寡核苷酸，所述功能保守序列與SEQ ID NO:1相比具有75%、80%、85%、90%、95%或大于95%、96%、97%、98%、99%的同一性且保留如SEQ ID NO:1的抑制IRS-1基因表達(dá)能力，和通過在眼后段內(nèi)給藥將所述組合物給予需要其的個體；本發(fā)明還涉及用于治療需要其的個體中眼睛內(nèi)部的病理性新生血管形成相關(guān)病癥的方法，該方法包括給予所述個體治療有效量的所述藥物組合物。
文檔編號A61P9/00GK103180444SQ201180048959
公開日2013年6月26日 申請日期2011年8月10日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月10日
發(fā)明者S·阿爾-瑪穆德, S·科蘭, J-P·柯都佐爾蓋茲, E·維奧德 申請人:基因信號國際公司