專利名稱：一種螨變應(yīng)原凍干疫苗及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種疫苗及其制備方法，具體地說，涉及一種螨變應(yīng)原凍干疫苗及其制備方法。
背景技術(shù)：
變態(tài)反應(yīng)性疾病被世界衛(wèi)生組織(WHO)認為是當前世界性的重大衛(wèi)生學(xué)問題， 2010年WHO把變態(tài)反應(yīng)性疾病列為世界上第四大類最主要的慢性疾病。世界各國變態(tài)反應(yīng)性疾病的總發(fā)病率約為10 20%，包括過敏性哮喘，是臨床常見病，多發(fā)病。當前，變態(tài)反應(yīng)疾病日趨嚴重，引起過敏的主要變應(yīng)原有塵螨、花粉、屋塵、霉菌、羽毛等，而塵螨是世界性分布最強烈的變應(yīng)原之一。哮喘是當今世界上最常見的疾患之一，哮喘患者約占人口總數(shù)的2_10%。全世界塵螨過敏的患者約有5000萬，由塵螨過敏誘發(fā)的哮喘占哮喘的比例為10-30%。在塵螨過敏患者中，45-80%患者患有哮喘，塵螨過敏是誘發(fā)哮喘的一個主要因素。能引起人類變態(tài)反應(yīng)疾病的塵螨主要有3種，即塵螨亞科中的塵螨屬(Dermatophagoides)的兩種戶塵螨 (D. pteronyssinus)和粉塵螨(D. farinae)，以及蚍螨亞科中一種歐塵螨屬(Euroglyphus) 的埋內(nèi)歐塵螨，三種塵螨在抗原性強度方面比較，粉塵螨和戶塵螨比埋內(nèi)歐塵螨強得多。變應(yīng)性鼻炎同樣是一個全球性健康問題，它在世界各地均常見，其全球發(fā)病率 10% _25%，并且患者數(shù)仍有上升趨勢。過敏性鼻炎嚴重影響了患者的日常生活、學(xué)習(xí)以及工作效率，增加了醫(yī)療的負荷。國內(nèi)外研究顯示，塵螨是變應(yīng)性鼻炎最主要的變應(yīng)原。目前，過敏性哮喘和過敏性鼻炎的治療一般分為兩種對癥治療和特異性免疫治療。對癥治療一般采用化學(xué)藥物，如抗組胺藥物和糖皮質(zhì)激素，化學(xué)藥物治療隨著治療時間的延長，會伴隨一系列不良反應(yīng)和副作用。如，化學(xué)藥物的耐藥性和糖皮質(zhì)激素的長期應(yīng)用對腎上腺皮質(zhì)功能的輕度抑制。過敏性疾病的特異性免疫治療自1911年noon和freeman 用花粉提取液治療枯草熱以來，已經(jīng)廣泛用于治療過敏性疾病，并且取的飛躍的發(fā)展。變應(yīng)原疫苗經(jīng)歷了粗浸液、純化變應(yīng)原疫苗、標準化變應(yīng)原疫苗、類變應(yīng)原疫苗的發(fā)展過程，在劑型上從皮下注射到舌下滴劑到舌下片劑的發(fā)展歷程。在皮下注射給藥和舌下含服給藥兩種給藥方式中，各有優(yōu)缺點。舌下給藥免疫治療病人更容易接受，依從好，但皮下注射給藥相比舌下給藥免疫治療療效快，治療周期短，對于一些重癥過敏患者，皮下注射給藥治療周期短，療效更快。在目前上市的注射用螨變應(yīng)原疫苗中，美國市場上常見的主要是甘油制劑，在歐洲變應(yīng)原疫苗生產(chǎn)企業(yè)制備的主要是含有氫氧化鋁佐劑的螨變應(yīng)原疫苗。甘油制劑螨變應(yīng)原疫苗由于含有50%的甘油，所以每次給藥最大體積不能超過0. anl，限制了其使用的方便性；再者相比凍干疫苗的形式，它的穩(wěn)定性不如凍干更穩(wěn)定，使用時，由于含有50%甘油，會增加患者的疼痛。含有氫氧化鋁佐劑的變應(yīng)原疫苗，雖然鋁鹽具有極佳的安全性和佐劑活性的追蹤記錄，但是在應(yīng)用鋁鹽時仍然存在一定的問題。這些問題包括局部反應(yīng)如紅斑、接觸性過敏、皮下小結(jié)、以及肉芽腫性炎癥、在實驗動物和人類中特定的和總的IgE抗體反應(yīng)增加(在某些病原情況下如過敏反應(yīng)中出現(xiàn)不希望出現(xiàn)的抗體類型)。此外，已經(jīng)報道了鋁鹽作為佐劑時對某些抗原無效。也有一些研究報道，鋁鹽能引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)實驗性的變性病癥。雖然仍沒有關(guān)于包括鋁的疫苗與人類的神經(jīng)變性病癥如阿爾茨海默氏疾病的發(fā)展有關(guān)臨床證據(jù)，但是已經(jīng)推定他們之間有聯(lián)系并且由此引發(fā)了廣泛的爭論。在過敏性疾病的治療過程中，不同于預(yù)防用疫苗，需要反復(fù)給藥，治療周期長達三年之久，在人體內(nèi)累積的鋁含量是不可忽視的問題。就穩(wěn)定性而言，含有氫氧化鋁佐劑的螨變應(yīng)原疫苗不如凍干后的變應(yīng)原疫苗更加穩(wěn)定。凍干技術(shù)已經(jīng)廣泛用于食品和生物制品行業(yè)中，在藥典三部記載的藥品中，除了含有氫氧化鋁佐劑的疫苗不是采用凍干的形式，其它藥品都有凍干劑型上市。已證明藥物凍干劑型不僅穩(wěn)定性好，而且安全性高。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明旨在克服現(xiàn)有螨變應(yīng)原疫苗的不足，提供一種新型的螨變應(yīng)原凍干疫苗及其制備方法。為了實現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明的一種螨變應(yīng)原凍干疫苗，其是由螨變應(yīng)原活性蛋白、凍干保護劑和PH7. 0-8. 5的磷酸鹽緩沖液按1 100-1000 70-140的重量比混合后凍干制成；其中，所述凍干保護劑為甘露醇、甘氨酸、人血白蛋白、葡萄糖、右旋糖酐、蔗糖、 乳糖或海藻糖中的一種或多種。優(yōu)選地，其是由螨變應(yīng)原活性蛋白、甘露醇和PH7. 0-8. 5的磷酸鹽緩沖液按 1 200 70的重量比混合后凍干制成。 優(yōu)選使用pH8. 0的磷酸鹽緩沖液。所述螨變應(yīng)原活性蛋白來自粉塵螨(Dermatophagoides farinae)變應(yīng)原和/或戶塵螨(Dermatophagoides pteronyssinus)變應(yīng)原。優(yōu)選所述螨變應(yīng)原活性蛋白來自粉塵螨變應(yīng)原和戶塵螨變應(yīng)原。更優(yōu)選所述螨變應(yīng)原活性蛋白來自等比例混合的粉塵螨變應(yīng)原和戶塵螨變應(yīng)原。本發(fā)明還提供上述螨變應(yīng)原凍干疫苗的制備方法，包括塵螨在培養(yǎng)基中的培養(yǎng)傳代、螨體的分離純化、活性蛋白的提取、活性蛋白的純化以及凍干的步驟，其中，采用甘露醇、甘氨酸、人血白蛋白、葡萄糖、右旋糖酐、蔗糖、乳糖或海藻糖中的一種或多種作為凍干保護劑。前述的方法，包括以下步驟1)在培養(yǎng)基中接種塵螨，培養(yǎng)傳代，收獲塵螨培養(yǎng)物，用95 %乙醇滅活30min，靜置后分層，棄去上清，所得固體物經(jīng)自然干燥后，分離純化螨體；2)向純化后的螨體中加入95%乙醇進行脫脂，直至上清液無色，靜置后分層，棄去上清，干燥所得固體物至無乙醇氣味；3)向干燥后的固體物中加入pH7. 0-8. 5的磷酸鹽緩沖液，攪拌后離心，得上清；過濾上清液，用截留分子量IkD IOkD的膜，以磷酸鹽緩沖液衡濾，直至濾出液無色；濾出液經(jīng)超濾濃縮后得螨變應(yīng)原活性蛋白原液；4)向上述原液中加入凍干保護劑，經(jīng)0. 22 μ m膜過濾除菌后，凍干即得。前述方法中凍干條件為以每分鐘2. 5 3. 5°C /min的速度將溫度降至-45°C，保持7 8h ；然后以每分鐘0. 3 0. 40C /min的速度將溫度升至_30°C，保持30 35h，維持真空度10 151 ；再以1. 5 2V /min速度將溫度升至25°C，保持50min，同時維持真空度為OPa ；再以0. 50C /min的速度將溫度升至30°C，保持60min。前述方法中，所述塵螨為粉塵螨變應(yīng)原和/或戶塵螨變應(yīng)原。優(yōu)選為粉塵螨變應(yīng)原和戶塵螨變應(yīng)原。更優(yōu)選為等比例混合的粉塵螨變應(yīng)原和戶塵螨變應(yīng)原。本發(fā)明的目的還可以采用以下的技術(shù)措施來進一步實現(xiàn)。1、原液制備1)戶塵螨變應(yīng)原活性蛋白原液的制備從工作種子庫取出一瓶戶塵螨工作種子，在25°C，相對濕度75% 士5%條件下放置15-30天復(fù)蘇。在解剖鏡下觀察螨生長狀況和活動度，螨生長良好，培養(yǎng)基沒有真菌污染，將工作種子按1 60-1 12(螨種培養(yǎng)物與培養(yǎng)基重量比)的比例接種培養(yǎng)基O份實驗動物飼料，2份酵母粉，1份豬肉粉)，于25°C、相對濕度75%條件下培養(yǎng)。戶塵螨培養(yǎng)約2-4個月后，解剖鏡下觀察生長增殖情況良好時，精確稱量全螨培養(yǎng)物在光學(xué)顯微鏡下用計數(shù)法計算蟲體密度。當蟲體密度達到約30-50只螨/mg培養(yǎng)物的標準即可收獲培養(yǎng)物。將戶塵螨培養(yǎng)物倒入三角瓶中，加入約2倍體積95%乙醇滅活30min，靜置徹底分層， 小心棄去上清液體，將固體物轉(zhuǎn)到濾紙上自然干燥，干燥過程中注意壓散結(jié)塊，最后所得的固體物為戶塵螨收獲物。以振動過篩的方法純化螨體，重復(fù)幾次，直到鏡檢雜質(zhì)含量不得多于10粒/百只螨。在純化后的螨體中加入約2倍體積的95%乙醇清洗一次，靜置分層，棄去上層液體。然后再加入2倍體積的95%乙醇脫脂，每振搖;3min后靜置lOmin，重復(fù)3次， 直到上清液無色為止。棄去廢液后將固體物在濾紙上攤開干燥至少4 至無乙醇氣味，干燥過程中注意壓散結(jié)塊。稱取脫脂的戶塵螨螨體原料，以1 50 1 10的投料比例置于pH8. 010 IOOmM磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液中4°C攪拌提取Mh，離心分離去除殘渣，濾液經(jīng)8 μ m、0. 45 μ m、0. 22 μ m膜逐級過濾澄清。用截留分子量IkD IOkD的膜，以 pH8. 050mM磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液衡濾，至濾出液為無色，超濾濃縮至體積為原體積的三分之一，收集回流液，經(jīng)0. 22 μ m膜過濾除菌后得戶塵螨變應(yīng)原活性蛋白原液。2)粉塵螨變應(yīng)原活性蛋白原液的制備從工作種子庫取出一瓶粉塵螨工作種子，在25°C，相對濕度65% 士5%條件下放置15-30天復(fù)蘇。在解剖鏡下觀察螨生長狀況和活動度，螨生長良好，培養(yǎng)基沒有真菌污染，將工作種子按1 60-1 12(螨種培養(yǎng)物與培養(yǎng)基重量比)的比例接種培養(yǎng)基(小麥胚芽粉酵母粉=1 1)，于25°C、相對濕度65% 士5%條件下培養(yǎng)。粉塵螨培養(yǎng)約2-4 個月后，解剖鏡下觀察生長增殖情況良好時，精確稱量全螨培養(yǎng)物在光學(xué)顯微鏡下用計數(shù)法計算蟲體密度。當蟲體密度達到約30-50只螨/mg培養(yǎng)物的標準即可收獲培養(yǎng)物。將粉塵螨培養(yǎng)物倒入三角瓶中，加入約2倍體積95%乙醇滅活30min，靜置徹底分層，小心棄去上清液體，將固體物轉(zhuǎn)到濾紙上自然干燥，干燥過程中注意壓散結(jié)塊，最后所得的固體物為粉塵螨收獲物。以振動過篩的方法純化螨體，直到鏡檢雜質(zhì)含量不得多于10粒/百只螨。 在純化后的螨體中加入約2倍體積的95%乙醇清洗一次，靜置分層，棄去上層液體。然后再加入2倍體積的95%乙醇脫脂，每振搖:3min后靜置lOmin，重復(fù)3次，直至上清液無色為止。棄去廢液后將固體物在濾紙上攤開干燥至少4 至無乙醇氣味，干燥過程中注意壓散結(jié)塊。稱取脫脂的粉塵螨螨體原料，以1 50 1 10的投料比例置于pH8. 010 IOOmM 磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液中4°C攪拌提取Mh，離心分離去除殘渣，濾液經(jīng)8 μ m、 0. 45 μ m、0. 22 μ m膜逐級過濾澄清。用截留分子量IkD IOkD的膜，以pH8. 050mM磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液衡濾，至濾出液為無色，超濾濃縮至體積為原體積的三分之一，收集回流液，經(jīng)0. 22 μ m膜過濾除菌后等粉塵螨變應(yīng)原活性蛋白原液。2、半成品的稀配和分裝凍干1)和2~)的原液經(jīng)檢驗，活性不小于40000AU，無菌生長，用甘露醇水溶液稀釋到規(guī)定濃度，甘露醇終濃度為2%。甘露醇溶液的配制方法按比例稱取適量的甘露醇，用60°C注射用水定容至終體積的1/3，當溫度降至30°C時，加入0. 2%針用活性炭，30°C攪拌30min。然后使用鈦棒將藥液過濾除去碳顆粒。脫碳后的甘露醇水溶液用60°C注射水定容至終體積，加入0. 05%針用活性炭，60°C攪拌吸附30分鐘，用0. 8μπι膜過濾，除去活性炭，0. 22 μ m膜過濾除菌。稀配后的螨變應(yīng)原原液經(jīng)0.22 μ m膜過濾除菌后分裝到西林瓶中，每瓶lml。半壓塞放入凍干機腔體內(nèi)，以每分鐘2. 5 3. 5°C /min的速度將溫度降至_45°C，保持7 他； 然后以每分鐘0. 3 0. 40C /min的速度將溫度升至_30°C，保持30 35h，維持腔內(nèi)真空度10 151 ；再以1. 5 2V /min速度將溫度升至25°C，保持50min，同時維持真空度為 OPa ；再以0. 50C /min的速度將溫度升至30°C，保持60min，同時維持真空度OPa，即得螨變應(yīng)原凍干疫苗。本發(fā)明的螨變應(yīng)原凍干疫苗與現(xiàn)已上市的螨變應(yīng)原疫苗的水制劑、甘油制劑、氫氧化鋁佐劑制劑相比，具有如下優(yōu)點(一)本發(fā)明的螨變應(yīng)原凍干疫苗，不僅克服了傳統(tǒng)變應(yīng)原疫苗甘油制劑使用的不方便性和水制劑的不穩(wěn)定性，例如，甘油制劑給病人帶來的疼痛和使用劑量的限制，而且克服了含有氫氧化鋁佐劑制劑因體內(nèi)鋁累積所帶來的危害及副作用，為塵螨過敏患者提供一種高效、穩(wěn)定性好、安全性好的疫苗制品。( 二)本發(fā)明突破變應(yīng)原行業(yè)產(chǎn)品的傳統(tǒng)，采用單劑量裝量，提高了變應(yīng)原疫苗使用的安全性和有效性。
具體實施例方式以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。實施例1戶塵螨變應(yīng)原凍干疫苗的制備從工作種子庫取出一瓶戶塵螨工作種子，在25 °C，相對濕度75%條件下放置25天復(fù)蘇。在解剖鏡下觀察螨生長狀況和活動度，螨生長良好，培養(yǎng)基沒有真菌污染，將工作種子按1 30(螨種培養(yǎng)物與培養(yǎng)基重量比)的比例接種培養(yǎng)基O份實驗動物飼料，2份酵母粉，1份豬肉粉)，于25°C、相對濕度75%條件下培養(yǎng)。戶塵螨培養(yǎng)約3個月后，解剖鏡下觀察生長增殖情況良好時，精確稱量全螨培養(yǎng)物在光學(xué)顯微鏡下用計數(shù)法計算蟲體密度。 當蟲體密度達到約50只螨/mg培養(yǎng)物的標準即可收獲培養(yǎng)物。將戶塵螨培養(yǎng)物倒入三角瓶中，加入約2倍體積95%乙醇滅活30min，靜置徹底分層，小心棄去上清液體，將固體物轉(zhuǎn)到濾紙上自然干燥，干燥過程中注意壓散結(jié)塊，最后所得的固體物為戶塵螨收獲物。以振動過篩的方法純化螨體，直到鏡檢雜質(zhì)含量不得多于10粒/百只螨。在純化后的螨體中加入約2倍體積的95%乙醇清洗一次，靜置分層，棄去上層液體。然后再加入2倍體積的95% 乙醇脫脂，每振搖:3min后靜置lOmin，重復(fù)3次，直到上清液無色為止，棄去廢液后將固體物在濾紙上攤開干燥至少4 至無乙醇氣味，干燥過程中注意壓散結(jié)塊。稱取脫脂的戶塵螨螨體原料，以1 50的投料比例置于50mM磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液中4°C攪拌提取Mh，5000rpm，4°C離心15min，取上清去殘渣。上清經(jīng)8 μ m、0. 45 μ m、0. 22 μ m膜逐級過濾澄清。用截留分子量5kD的膜，以pH8的50mM磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液衡濾，至濾出液無色為止，超濾濃縮至體積為原體積的三分之一，收集回流液，經(jīng)0. 22 μ m膜過濾除菌得戶塵螨變應(yīng)原活性蛋白原液。原液經(jīng)檢驗，活性不小于40000AU，無菌生長，用甘露醇水溶液稀釋到規(guī)定濃度，甘露醇終濃度為2%。甘露醇溶液)的配制按比例稱取適量甘露醇，用60°C注射用水定容至終體積的1/3，當溫度降至30°C時，加入0. 2%針用活性炭，30°C攪拌30min。然后使用鈦棒將藥液過濾除去碳顆粒。脫碳后的甘露醇溶液用60°C注射水定容至終體積，加入0. 05%針用活性炭，60°C攪拌吸附30分鐘，用0. 8 μ m膜過濾，除去活性炭，經(jīng)0. 22 μ m膜過濾除菌。稀配后的戶塵螨變應(yīng)原活性蛋白原液經(jīng)0.22 μ m膜過濾除菌后分裝到西林瓶中，每瓶1ml。半壓塞放入凍干機腔體內(nèi)，以每分鐘2. 5 3. 50C /min的速度將溫度降至_45°C，保持他；然后以每分鐘0. 40C /min的速度將溫度升至_30°C，保持30h，維持腔內(nèi)真空度151 ；再以2V /min速度將溫度升至25°C，保持50min，同時維持真空度為OPa ；再以0. 5°C /min的速度將溫度升至30°C，保持60min，同時維持真空度OPa，即得戶塵螨變應(yīng)原凍干疫苗。對所得凍干疫苗進行檢驗，結(jié)果如表1所示表1戶塵螨變應(yīng)原凍干疫苗的檢驗
檢驗項目
標準規(guī)定
檢驗結(jié)果
性狀
水分活性 Derpl Derp2
無菌
無色疏松體，溶解后無色或
淡黃色澄明液體
<3%
10000AU-40000AU/ml
不得檢出有菌生長
符合規(guī)定 1.7%
25000AU
9.8pg/ml
10.2pg/ml
符合規(guī)定注Derpl為戶塵螨變應(yīng)原主要致敏蛋白1 ；Derp2為戶塵螨變應(yīng)原主要致敏蛋白 2。實施例2粉塵螨變應(yīng)原凍干疫苗的制備從工作種子庫取出一瓶粉塵螨工作種子，在25 °C，相對濕度65%條件下放置 15-30天復(fù)蘇。在解剖鏡下觀察螨生長狀況和活動度，螨生長良好，培養(yǎng)基沒有真菌污染，將工作種子按1 30 (螨種培養(yǎng)物與培養(yǎng)基重量比)的比例接種培養(yǎng)基(小麥胚芽粉酵母粉=1 1)，于25°C、相對濕度65%條件下培養(yǎng)。粉塵螨培養(yǎng)約3個月后，解剖鏡下觀察生長增殖情況良好時，精確稱量全螨培養(yǎng)物在光學(xué)顯微鏡下用計數(shù)法計算蟲體密度。當蟲體密度達到約50只螨/mg培養(yǎng)物的標準即可收獲培養(yǎng)物。將粉塵螨培養(yǎng)物倒入三角瓶中，加入約2倍體積95%乙醇滅活30min，靜置徹底分層，小心棄去上清液體，將固體物轉(zhuǎn)到濾紙上自然干燥，干燥過程中注意壓散結(jié)塊，最后所得的固體物為粉塵螨塵螨收獲物。以振動過篩的方式純化螨體，反復(fù)純化幾次，直到鏡檢雜質(zhì)含量不得多于10粒/百只螨。在純化后的螨體中加入約2倍體積的95%乙醇清洗一次，靜置分層，棄去上層液體。然后再加入2倍體積的95%乙醇脫脂，每振搖:3min后靜置lOmin，重復(fù)3次，直到上清液無色為止，棄去廢液后將固體物在濾紙上攤開干燥至少4 至無乙醇氣味，干燥過程中注意壓散結(jié)塊。稱取脫脂的粉塵螨螨體原料，以1 50的投料比例置于50mM磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液中 4°C攪拌提取Mh，5000rpm, 4°C離心15min，取上清去殘渣。上清經(jīng)8 μ m、0. 45 μ m、0. 22 μ m 膜逐級過濾澄清。用截留分子量5kD的膜，以pH8的50mM磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉衡濾， 到濾出液無色為時，超濾濃縮至體積為原體積的三分之一，收集回流液，經(jīng)0. 22 μ m膜過濾除菌得粉塵螨變應(yīng)原活性蛋白原液。原液經(jīng)檢，活性不小于40000AU，無菌生長，用甘露醇水溶液稀釋到規(guī)定濃度，甘露醇終濃度為2%。甘露醇溶液)的配制按比例稱取適量甘露醇，用60°C注射用水定容至終體積的1/3，當溫度降至30°C時，加入0. 2%針用活性炭，30°C攪拌30min。然后使用鈦棒將藥液過濾除去碳顆粒。脫碳后的甘露醇溶液用60°C注射水定容至終體積，加入0. 05%針用活性炭，60°C攪拌吸附30分鐘，用0. 8 μ m膜過濾，除去活性炭，經(jīng)0. 22 μ m膜過濾除菌。稀配后的粉塵螨變應(yīng)原活性蛋白原液0.22 μ m過濾除菌后分裝到西林瓶中，每瓶 Iml0半壓塞放入凍干機腔體內(nèi)，以每分鐘3°C /min的速度將溫度降至_45°C，保持他；然后以每分鐘0. 40C /min的速度將溫度升至_30°C，保持30h，維持腔內(nèi)真空度10 151 ；再以2V /min速度將溫度升至25°C，保持50min，同時維持真空度為OPa ；再以0. 5°C /min的速度將溫度升至30°C，保持60min，同時維持真空度OPa，即得粉塵螨變應(yīng)原凍干疫苗。對所得凍干疫苗進行檢驗，結(jié)果如表2所示表2粉塵螨變應(yīng)原凍干疫苗的檢驗
檢驗項目標準規(guī)定檢驗結(jié)果性狀無色疏松體，溶解后無色或符合規(guī)定淡黃色澄明液體水分<3%1.6%活性10000AU-40000AU/ml23 OOOAUDerfl10.8pg/mlDer￡292\xglm\無菌不得檢出有菌生長符合規(guī)定注Derfl為粉塵螨變應(yīng)原主要致敏蛋白1 ；Derf2為粉塵螨變應(yīng)原主要致敏蛋白 2。實施例3戶塵螨和粉塵螨變應(yīng)原凍干疫苗的制備戶塵螨變應(yīng)原活性蛋白原液和粉塵螨變應(yīng)原活性蛋白原液按實施例1和實施例2 制備，原液檢驗合格后，用甘露醇溶液稀釋至20000AU，甘露醇終濃度為2%。將稀釋后的戶塵螨變應(yīng)原活性蛋白原液和粉塵螨變應(yīng)原活性蛋白原液以1 1混合(體積比)，過濾除菌分裝到西林瓶中，每瓶1ml。半壓塞放入凍干機前箱內(nèi)，按實施例1和實施例2的凍干工藝凍干，即得塵螨變應(yīng)原合劑凍干疫苗。。對所得凍干疫苗進行檢驗，結(jié)果如表3所示 表3塵螨變應(yīng)原合劑凍干疫苗的檢驗
權(quán)利要求
1.一種螨變應(yīng)原凍干疫苗，其特征在于，其是由螨變應(yīng)原活性蛋白、凍干保護劑和 PH7. 0-8. 5的磷酸鹽緩沖液按1 100-1000 70-140的重量比混合后凍干制成；其中，所述凍干保護劑為甘露醇、甘氨酸、人血白蛋白、葡萄糖、右旋糖酐、蔗糖、乳糖或海藻糖中的一種或多種。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的凍干疫苗，其特征在于，其是由螨變應(yīng)原活性蛋白、甘露醇和 pH7. 0-8. 5的磷酸鹽緩沖液按1 200 70的重量比混合后凍干制成。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的凍干疫苗，其特征在于，所述磷酸鹽緩沖液的PH值為8. 0。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的凍干疫苗，其特征在于，所述螨變應(yīng)原活性蛋白來自粉塵鋼(Dermatophagoides farinae)變應(yīng)原禾口 / 或戶塵鋼(Dermatophagoides pteronyssinus)變應(yīng)原。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的凍干疫苗，其特征在于，所述螨變應(yīng)原活性蛋白來自粉塵螨變應(yīng)原和戶塵螨變應(yīng)原。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的凍干疫苗，其特征在于，所述螨變應(yīng)原活性蛋白來自等比例混合的粉塵螨變應(yīng)原和戶塵螨變應(yīng)原。
7.制備權(quán)利要求1-6任一項所述凍干疫苗的方法，包括塵螨在培養(yǎng)基中的培養(yǎng)傳代、 螨體的分離純化、活性蛋白的提取、活性蛋白的純化以及凍干的步驟，其特征在于，采用甘露醇、甘氨酸、人血白蛋白、葡萄糖、右旋糖酐、蔗糖、乳糖或海藻糖中的一種或多種作為凍干保護劑。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，包括以下步驟1)在培養(yǎng)基中接種塵螨，培養(yǎng)傳代，收獲塵螨培養(yǎng)物，用95%乙醇滅活30min，靜置后分層，棄去上清，所得固體物經(jīng)自然干燥后，分離純化螨體；2)向純化后的螨體中加入95%乙醇進行脫脂，直至上清液無色，靜置后分層，棄去上清，干燥所得固體物至無乙醇氣味；3)向干燥后的固體物中加入pH7.0-8. 5的磷酸鹽緩沖液，攪拌后離心，得上清；過濾上清液，用截留分子量IkD IOkD的膜，以磷酸鹽緩沖液衡濾，直至濾出液無色；濾出液經(jīng)超濾濃縮后得螨變應(yīng)原活性蛋白原液；4)向上述原液中加入凍干保護劑，經(jīng)0.22 μ m膜過濾除菌后，凍干即得。
9.根據(jù)權(quán)利要求7或8所述的方法，其特征在于，凍干條件為以每分鐘2.5 3.5°C/ min的速度將溫度降至-45 °C，保持7 8h ；然后以每分鐘0. 3 0. 4°C /min的速度將溫度升至_30°C，保持30 35h，維持真空度10 151 ；再以1. 5 2°C /min速度將溫度升至 25°C，保持50min，同時維持真空度為OPa ；再以0. 5°C /min的速度將溫度升至30°C，保持 60mino
10.根據(jù)權(quán)利要求7或8所述的方法，其特征在于，所述塵螨為等比例混合的粉塵螨變應(yīng)原和戶塵螨變應(yīng)原。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種新型的螨變應(yīng)原凍干疫苗及其制備方法，所述疫苗是由螨變應(yīng)原活性蛋白、凍干保護劑和pH7.0-8.5的磷酸鹽緩沖液按1∶100-1000∶70-140的重量比混合后凍干制成。本發(fā)明的螨變應(yīng)原凍干疫苗與傳統(tǒng)的螨變應(yīng)原疫苗的水制劑、甘油制劑、氫氧化鋁佐劑制劑相比，克服了變應(yīng)原疫苗甘油制劑使用的不方便性和水制劑的不穩(wěn)定性以及含有氫氧化鋁佐劑制劑所帶來的副作用，為塵螨過敏患者提供一種高效、穩(wěn)定性好、安全性好的疫苗制品。
文檔編號A61K39/35GK102258780SQ201110199519
公開日2011年11月30日 申請日期2011年7月15日 優(yōu)先權(quán)日2011年7月15日
發(fā)明者喬秉善, 姜敏, 湯承祁, 牛占坡, 白彩明, 裴瀟竹 申請人:北京新華聯(lián)協(xié)和藥業(yè)有限責(zé)任公司