專利名稱：丹參酮在治療血管平滑肌細(xì)胞異常增殖疾病藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及中藥丹參提取物丹參酮的用途，特別涉及丹參酮在制備治療以血管平滑肌細(xì)胞異常增殖為主要病理變化特征的疾病的藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
丹參系唇形科鼠尾草屬植物的根，為常用的活血化瘀中藥。其性微寒，味苦、無毒。有活血通經(jīng)、涼血消腫、除煩清心的功能。丹參有15種成分，它們是丹參酮I(I)、丹參酮IIA(II)、丹參酮IIB(III)、隱丹參酮(IV)、異丹參酮I(V)、異丹參酮IIA(VI)、異隱丹參酮(VII)、羥基丹參酮IIA(VIII)、丹參酸甲酯(IX)、Miltirone(X)、Salviol(XI)、二氫丹參酮I(XII)、丹參新醌甲(XIII)、丹參新醌乙(XIV)和丹參新醌丙(XV)。因此，可用丹參提取丹參酮。
丹參酮制備的藥物已在臨床上獲得了應(yīng)用，但通常用于扁桃體炎、耳癤、化膿性骨髓炎、燒傷中的金葡萄菌感染的治療，冠心病的治療，抗動脈粥樣硬化。
中國專利申請99121460.9公開了丹參酮的一種新用途，即在制備治療腫瘤藥物中的應(yīng)用。
目前，器官移植存活率較低，皮腔內(nèi)冠脈成形術(shù)(PTCA術(shù))后再狹窄率高達(dá)30％～50％，這些疾病嚴(yán)重威脅人類健康。研究發(fā)現(xiàn)，這些疾病有一個共同的病理特征，即血管平滑肌細(xì)胞異常增殖，而現(xiàn)有的抑制血管平滑肌細(xì)胞異常增殖的藥物有尼群地平、激素(如雄二醇)、胸苷激酶基因等，使用這些藥物治療不僅費用高，而且療效不明顯，尤其是激素對人體的副作用較大。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明針對現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，提供一種丹參酮的新用途，即在制備治療以血管平滑肌細(xì)胞異常增殖為主要病理變化特征的疾病的藥物中的應(yīng)用。
為了便于理解本發(fā)明，下面以丹參酮IIA的藥理試驗及結(jié)果予以說明。將從丹參中提取的丹參酮IIA用四甲基偶氮唑蘭比色法測定細(xì)胞線粒體脫氫酶活性，用以評價丹參酮IIA的細(xì)胞毒性；在堿性纖維母細(xì)胞生長因子誘導(dǎo)的人血管平滑肌細(xì)胞增殖模型上，用氫標(biāo)胸腺嘧啶脫氧核苷摻入法觀察該藥對DNA合成的影響；用細(xì)胞計數(shù)法測定該藥對血管平滑肌細(xì)胞增殖的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在無細(xì)胞毒性的濃度范圍內(nèi)，丹參酮IIA劑量依賴性的抑制堿性纖維母細(xì)胞生長因子誘導(dǎo)的人血管平滑肌細(xì)胞DNA的合成，IC50為2.8μmol/L，丹參酮IIA15μmol/L孵育6天，顯著抑制細(xì)胞增殖(P＜0.05)。
將體外培養(yǎng)的家兔主動脈中膜平滑肌細(xì)胞和第三代亞融合的肺動脈平滑肌細(xì)胞(PASMC)用丹參酮IIA作藥理試驗表明巨噬細(xì)胞源性生長因子可明顯促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞c-myc基因高表達(dá)，丹參酮IIA具有阻止巨噬細(xì)胞源性生長因子刺激血管平滑肌細(xì)胞的作用，使c-myc基因表達(dá)水平下降；丹參酮IIA硫酸鈉能明顯抑制PASMC由G期進(jìn)入S期(P＜0.05)，使PASMC增殖細(xì)胞核抗原的表達(dá)及PDGF-A和B鏈mRNA的表達(dá)均顯著降低(P＜0.01)。
丹參酮IIA的上述藥理試驗及結(jié)果提示，丹參酮對生長因子為始因引起的皮腔內(nèi)冠脈成形術(shù)后再狹窄、移植器官動脈硬化、慢性高血壓等疾病具有積極的治療作用。
丹參酮藥物的制備取一定量丹參，粉碎后裝入索氏提取器，用5～7倍量60～95％乙醇回流，每次3～5小時，共提取2～3次，合并提取液，然后將提取液濃縮、噴霧干燥即可得丹參酮粉末，將丹參酮粉末加入藥學(xué)上允許的載體或賦形劑和可選的其它成分，即可制備成各種劑型的藥物，給藥方式有口服和注射。
本發(fā)明具有以下有益效果1、發(fā)掘了丹參酮的新醫(yī)療用途，開拓了一個新的應(yīng)用領(lǐng)域。
2、丹參酮對血管平滑肌細(xì)胞的異常增殖有很強(qiáng)的抑制作用，因而用該物質(zhì)配制的藥物對防治以血管平滑肌細(xì)胞異常增殖為主要病理變化特征的疾病有良好的療效，有利于改變目前國際國內(nèi)此類疾病有效治療藥物嚴(yán)重缺乏的現(xiàn)狀，推動器官移植學(xué)與介入治療學(xué)的發(fā)展。
3、丹參酮為丹參的提取物，毒副作用小，藥理作用強(qiáng)，具有良好的藥用前景。
4、丹參來源豐富、價廉，丹參酮的提取工藝簡單，因而具有很好的工業(yè)化應(yīng)用前景。
具體實施例方式
下面通過實施例的描述，進(jìn)一步說明但不限制本發(fā)明。
實施例1 丹參酮IIA抑制人血管平滑肌細(xì)胞增殖的體外研究將體外培養(yǎng)的人動脈平滑肌細(xì)胞分為5組，分別為空白組及不同劑量的丹參酮IIA組，劑量分別為75μmol/L，15μmol/L，3μmol/L，0.6μmol/L。用四甲基偶氮唑蘭比色法測定細(xì)胞線粒體脫氫酶活性，以評價丹參酮IIA的細(xì)胞毒性；在堿性纖維母細(xì)胞生長因子誘導(dǎo)的人血管平滑肌細(xì)胞增殖模型上，用氫標(biāo)胸腺嘧啶脫氧核苷摻入法觀察該藥對DNA合成的影響；用細(xì)胞計數(shù)法測定該藥對血管平滑肌細(xì)胞增殖的影響；用t檢驗進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理。
結(jié)果發(fā)現(xiàn)，75μmol/L劑量組有細(xì)胞毒性，在無細(xì)胞毒性的其他濃度范圍內(nèi)，丹參酮IIA劑量依賴性的抑制堿性纖維母細(xì)胞生長因子誘導(dǎo)的人血管平滑肌細(xì)胞DNA的合成，IC50為2.8μmol/L，丹參酮IIA15μmol/L孵育6天，顯著抑制細(xì)胞增殖(P＜0.05)。
實施例2 丹參酮IIA抑制巨噬細(xì)胞源性生長因子刺激血管平滑肌細(xì)胞c-myc基因表達(dá)的實驗研究將體外培養(yǎng)的家兔主動脈中膜平滑肌細(xì)胞，5天換液一次，培養(yǎng)15天。再分別用正常對照組培養(yǎng)液(含5％PPS的DMEM，不含生長因子)、陽性刺激組培養(yǎng)液(即Mp-CM，含巨噬細(xì)胞源性生長因子)、丹參酮IIA實驗組培養(yǎng)液(含20mg/L丹參酮IIA的Mp-CM)培養(yǎng)。48小時后，用含4％(W/V)多聚甲醛、0.1％戊二醛和4％蔗糖的PBS(pH7.4)洗3次，每次10分鐘，用DEPC處理過的雙蒸水洗1次，然后浸入70％乙醇中保存。將保存的雜交樣品用c-myc基因探針進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)原位雜交，顯微鏡下進(jìn)行陽性細(xì)胞計數(shù)。
結(jié)果表明，巨噬細(xì)胞源性生長因子可明顯促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞c-myc基因高表達(dá)，丹參酮IIA具有阻止巨噬細(xì)胞源性生長因子刺激血管平滑肌細(xì)胞的作用，使c-myc基因表達(dá)水平下降，表明丹參酮IIA可通過降低c-myc表達(dá)而抑制血管平滑肌細(xì)胞異常增殖。
實施例3 丹參酮IIA硫酸鈉對低氧誘導(dǎo)肺血管平滑肌細(xì)胞增殖的影響研究取第三代亞融合的肺動脈平滑肌細(xì)胞(PASMC)，按加入培養(yǎng)液的不同分為6組正常對照組(N)、正常加藥對照組(N+DS201)、常氧內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)液組(NECCM)、NECCM+DS201組、低氧內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)液組(HECCM)、HECCM+DS201組。各加藥組藥物濃度均為5μmol/L。分組培養(yǎng)24小時后，經(jīng)固定后行免疫細(xì)胞化學(xué)染色，光鏡下由各組隨機(jī)選取20個陽性PASMC，用TJTY-300型全自動圖像分析儀檢測胞漿及核內(nèi)雜交顆粒的平均光密度值(OD值)。取第三代亞融合的PASMC分組繼續(xù)培養(yǎng)24小時，1g/L胰蛋白酶消化后制備成單細(xì)胞懸液。PBS洗滌2次，700ml/L冷乙醇(4℃)固定2小時，碘化吡啶染色30分鐘，用FACsort型流式細(xì)胞儀(FCM)分析PASMC細(xì)胞周期中各期細(xì)胞數(shù)占細(xì)胞總數(shù)的百分值。用PDGF-AcDNA片段和PDGF-BcDNA片段作為探針進(jìn)行細(xì)胞原位雜交，并對細(xì)胞增殖周期進(jìn)行分析。對所測得的數(shù)據(jù)用t檢驗進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理。
結(jié)果發(fā)現(xiàn)，丹參酮IIA硫酸鈉能明顯抑制PASMC由G期進(jìn)入S期(P＜0.05)，使PASMC增殖細(xì)胞核抗原的表達(dá)及PDGF-A和B鏈mRNA的表達(dá)均顯著降低(P＜0.01)。提示，丹參酮IIA硫酸鈉可能通過下調(diào)PDGFmRNA基因表達(dá)而有效抑制HECCM誘導(dǎo)的PASMC增殖。
權(quán)利要求
1.丹參酮在制備治療以血管平滑肌細(xì)胞異常增殖為主要病理變化特征的疾病的藥物中的應(yīng)用。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于以血管平滑肌細(xì)胞異常增殖為主要病理變化特征的疾病包括皮腔內(nèi)冠脈成形術(shù)后再狹窄、移植器官動脈硬化、慢性高血壓。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的應(yīng)用，其特征在于丹參酮為丹參酮IIA。
全文摘要
本發(fā)明涉及丹參酮在制備治療以血管平滑肌細(xì)胞異常增殖為主要病理變化特征的疾病的藥物中的應(yīng)用。藥理試驗表明，在無細(xì)胞毒性的濃度范圍內(nèi)，丹參酮IIA劑量依賴性的抑制堿性纖維母細(xì)胞生長因子誘導(dǎo)的人血管平滑肌細(xì)胞DNA的合成，IC50為2.8μmol/L，丹參酮IIA15mol/L孵育6天，顯著抑制細(xì)胞增殖(P＜0.05)。上述藥理試驗提示，丹參酮對生長因子為始因引起的皮腔內(nèi)冠脈成形術(shù)后再狹窄、移植器官動脈硬化、慢性高血壓等疾病具有積極治療作用。
文檔編號A61K31/343GK1489999SQ0213391
公開日2004年4月21日 申請日期2002年10月18日 優(yōu)先權(quán)日2002年10月18日
發(fā)明者杜俊蓉 申請人:四川大學(xué)