專利名稱：一種仔豬副傷寒活疫苗的生產(chǎn)方法
一種仔豬副傷寒活疫苗的生產(chǎn)方法
背景技術(shù)：
i^Wli^M (Paratyphus swine) X^W^^^M'^ (Swine salmonellosis), ± 要是由豬霍亂沙門氏菌(Salmonella choleraesuis)引起的一種仔豬高熱傳染病，目前主 要通過接種疫苗進(jìn)行預(yù)防。仔豬副傷寒主要是由豬霍亂沙門氏菌引起幼豬和架子豬的敗血癥和腸炎，對(duì)成年 豬多呈隱性帶菌或?yàn)樨i瘟的繼發(fā)感染菌，間或引起人類的食物中毒以及侵害其他動(dòng)物。我國應(yīng)用的仔豬副傷寒活疫苗CVCC500株(原C500株)(房曉文，李陽隴，黃昌 炳，鄭明，馮文達(dá)，孫偉等.仔豬副傷寒弱毒菌苗的研究，畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)，1979)，對(duì)仔豬有堅(jiān) 強(qiáng)免疫力，毒力穩(wěn)定、安全，在豬沙門氏菌病防控中發(fā)揮了重要作用。但仍存在以下突出問 題1.疫苗采用普通肉湯作為培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基主要成分牛肉浸液的質(zhì)量受牛肉的種類、 年齡、新鮮及消化程度影響大，造成批次間不穩(wěn)定。2.疫苗采用1.5%明膠、5%蔗糖為保護(hù) 劑，組方簡單，凍干存活率低，保護(hù)功能較差(尤其在較高溫度下)。目前國內(nèi)14個(gè)生產(chǎn)仔 豬副傷寒活疫苗的獸用生物制品企業(yè)，凍干存活率一般為50% 60%，需要-15°C以下保 存。存活率低使疫苗中含有大量死亡菌體，死亡菌體崩解產(chǎn)生的內(nèi)毒素，是產(chǎn)生過敏反應(yīng)的 因素之一，另外低溫保存給邊遠(yuǎn)地區(qū)儲(chǔ)運(yùn)和使用帶來困難。據(jù)報(bào)道，每年0. 07% 0. 的 豬接種后出現(xiàn)嘔吐、痙攣、全身發(fā)疳、死亡等癥狀。本發(fā)明的目的是研究一種合成培養(yǎng)基、耐熱保護(hù)劑及其相配套的凍干曲線，制備 一種凍干菌存率高，能在2 8°C長期保存的仔豬副傷寒活疫苗。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的技術(shù)方案是將種子液按培養(yǎng)基總量的 2%接種于液體培養(yǎng)基中， 37°C發(fā)酵或通氣培養(yǎng)18 21h，培養(yǎng)過程中根據(jù)需要加入適量消泡劑，并根據(jù)pH升高情況 加入適量滅菌40%葡萄糖以控制pH值。培養(yǎng)結(jié)束后立即加入經(jīng)過滅菌并預(yù)熱至37°C的凍 干保護(hù)劑，充分混勻后按規(guī)定頭份分裝。分裝過程中應(yīng)注意保溫振搖均勻，每頭份活菌數(shù)不 少于 3X109CFU。1生產(chǎn)菌株(1)菌株來源豬霍亂沙門氏菌CVCC79500株(即原C500株)，由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所鑒定、保 管和供應(yīng)。其原始菌種系豬霍亂沙門氏菌CVCC79101株(來自蘇聯(lián)獸藥監(jiān)察所，編號(hào)為 133/8。特性該菌種肉肝胃培養(yǎng)物50X IO4CFU活菌致死小鼠，5000X IO4CFU活菌致死海豬， 1.5X IO8CFU活菌靜脈注射致死仔豬。血清型6，7:C:1，5。)經(jīng)0. 05% 1 %醋酸鉈的普 通肉湯傳500代，每間隔50代逐步提高醋酸鉈濃度，人工致弱而來。(2)菌株特性1)毒力用體重18 22g(30 35日齡)小白鼠皮下注射1 X IO8CFU活菌 (0. 2ml)，90%以上存活；豚鼠(350 400g)皮下注射15 X IO8CFU活菌，90%以上存活；家 兔(體重1.5 2. Okg)皮下注射100 X IO8CFU活菌(1ml)，100%存活；仔豬(體重15kg以
3上)靜脈注射30X IO8CFU活菌(Iml)，100%存活。2)菌株穩(wěn)定性在普通瓊脂上連傳20代，或在仔豬連通過3代，毒力不返強(qiáng)。3)免疫原性以25X IO8CFU活菌免疫家兔(體重1. 5kg)，一個(gè)月后攻擊2 4MLD(最小致死劑量)強(qiáng)毒菌，保護(hù)80%以上；以25 X IO8CFU活菌免疫仔豬(體重12kg)， 靜脈注射致死劑量強(qiáng)毒，保護(hù)60%以上(中華人民共和國農(nóng)業(yè)部.中華人民共和國獸用生 物制品規(guī)程二〇〇〇版.化學(xué)工藝出版社，2000，以下稱《規(guī)程》)。2.疫苗制造及半成品檢驗(yàn)(1)生產(chǎn)用種子制備將豬霍亂沙門氏菌(CVCC79500株)凍干菌種用普通肉湯稀釋后，接種普通瓊脂平 板，37°C培養(yǎng)18 20h，選取中等大小的典型菌落(菌落為圓形、邊緣整齊、突起、半透明、略 濕潤的光滑型)5 10個(gè)，混合接種于普通瓊脂斜面3 5支，37°C培養(yǎng)24h，經(jīng)純粹檢查合 格后作為一級(jí)種子。在2 8°C保存，應(yīng)不超過2個(gè)月。取一級(jí)種子按2%接種普通肉湯， 37°C培養(yǎng)24h，純粹檢查合格后，作為種子液。(2)培養(yǎng)基本發(fā)明所采用的培養(yǎng)基是普通肉湯培養(yǎng)基(中國獸藥典委員會(huì).中華人民共和國 獸藥典二〇〇五版三部.北京中國農(nóng)業(yè)出版社，2006年，以下稱《中國獸藥典》)或/和合
成培養(yǎng)基。本發(fā)明所述的合成培養(yǎng)基配方及配制方法如下胰酪蛋白胨 2%，酵母浸出粉3% 4 %，氯化鈉0.05%，磷酸二氫鉀 0. 0077%，磷酸氫二鈉0. 0867%，注射用水；按配方依次稱取培養(yǎng)基成分加入到注射用水中，充分溶解后用2mol/L的氫氧化 鈉溶液調(diào)節(jié)PH值為7. 2 7. 4，116°C滅菌30min，臨用時(shí)，無菌操作加入終濃度的50% 葡萄糖溶液，混勻。(3)保護(hù)劑的配制1)保護(hù)劑的配方水溶性明膠10g，聚乙烯吡咯烷酮(PVP) Ig,山梨醇50g，蔗糖50g，199培養(yǎng)基5g， L-谷氨酸鈉5g，磷酸氫二鉀1. 25g，磷酸二氫鉀0. 52g，注射用水1000ml。2)配制方法溶液1 在潔凈燒杯中，加入注射用水(100°C )適量，按配方依次稱取水溶性明 膠、PVP、山梨醇，加入燒杯中，邊加入邊用玻璃棒攪拌，使其完全溶解，再用注射用水定容至 500ml，經(jīng) 116°C 滅菌 30min。溶液2 按配方依次稱取蔗糖、199培養(yǎng)基、L-谷氨酸鈉、磷酸二氫鉀和磷酸氫二鉀 于燒杯中，加入注射用水使其充分溶解后，定容至500ml，0. 22 μ m濾膜的除菌濾器過濾除 菌。3)配苗前，在無菌條件下，將溶液1和溶液2等體積混勻，即成。(3)制苗用菌液制備將豬霍亂沙門氏菌(CVCC79500株)種子液按培養(yǎng)基總量的 2%接種于液體 培養(yǎng)基(普通肉湯培養(yǎng)基或本發(fā)明提供的液體合成培養(yǎng)基)中，37°C發(fā)酵或通氣培養(yǎng)18 21h，培養(yǎng)過程中根據(jù)需要加入適量消泡劑，并根據(jù)pH升高情況加入適量滅菌40%葡萄糖
4以控制PH值。培養(yǎng)結(jié)束后，3500r/min離心20min，去上清，菌泥立即加入經(jīng)過滅菌處理并 預(yù)熱至37°C的耐熱保護(hù)劑懸浮，充分混勻后按規(guī)定頭份分裝。分裝過程中應(yīng)注意保溫振搖 均勻。凍干分裝后迅速進(jìn)行冷凍真空干燥，按《中國獸藥典》規(guī)定的方法、使用本發(fā)明提 供的凍干曲線2(見圖2)進(jìn)行。(4)半成品檢驗(yàn)純粹檢驗(yàn)取菌液用普通瓊脂平板，按《中國獸藥典》規(guī)定的方法進(jìn)行，應(yīng)純粹。活菌計(jì)數(shù)取樣用普通瓊脂平板培養(yǎng)計(jì)活菌數(shù)，按《中國獸藥典》規(guī)定的方法進(jìn)行， 作為計(jì)算凍干活菌率的基數(shù)及配苗時(shí)參考。凍干后檢驗(yàn)純粹檢驗(yàn)按《中國獸藥典》規(guī)定的方法進(jìn)行，應(yīng)純粹。頭份、活菌率的計(jì)算用普通瓊脂平板培養(yǎng)計(jì)活菌數(shù)，按附錄《中國獸藥典》規(guī)定的 方法進(jìn)行。以3瓶中最低菌數(shù)計(jì)算核定該批疫苗每瓶的使用頭份，同時(shí)按附注方法計(jì)算凍 干后的活菌率，以確定使用方法?；罹试?0%以上的疫苗，可用于注射或口服；低于50% 的疫苗，僅限于口服。3成品檢驗(yàn)性狀白色海綿狀疏松團(tuán)塊，易與瓶壁脫離，加稀釋液后迅速溶解。純粹檢驗(yàn)按《中國獸藥典》規(guī)定的方法進(jìn)行檢驗(yàn)，應(yīng)純粹?；罹?jì)數(shù)按瓶簽注明頭份，用普通瓊脂平板做活菌計(jì)數(shù)(按《中國獸藥典》規(guī)定的 方法進(jìn)行)，每頭份含活菌數(shù)應(yīng)不少于3X 109CFU。安全檢驗(yàn)按瓶簽注明頭份，將疫苗用普通肉湯或蛋白胨水稀釋，皮下注射體重 1.5 2. Okg兔2只，各1.0ml(含2頭份)，觀察21日，應(yīng)存活。剩余水分測定按《中國獸藥典》規(guī)定的方法進(jìn)行測定，應(yīng)不超過4. 0%。真空度測定按《中國獸藥典》規(guī)定的方法進(jìn)行測定。貯藏與有效期2 8°C保存，有效期至少為18個(gè)月。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)本發(fā)明涉及一種仔豬副傷寒活疫苗的生產(chǎn)方法。在本發(fā)明提供的生產(chǎn)方法中采用 了合成培養(yǎng)基和耐熱凍干保護(hù)劑及其相適應(yīng)的凍干曲線一整套技術(shù)，提高豬霍亂沙門氏菌 CVCC79500株培養(yǎng)菌數(shù)，保證批次間穩(wěn)定性，減少凍干過程的損失率，降低菌體死亡和代謝 副產(chǎn)物產(chǎn)生的過敏反應(yīng)，將成品疫苗的保存溫度提高到2 8°C，有效期達(dá)到18 24個(gè)月， 并可實(shí)現(xiàn)較高溫度短期保存(37°C保存7日，活菌減少率低于20% )。


圖1 凍干曲線1示意圖。-35°C進(jìn)箱；_40°C維持約4h ；產(chǎn)品由_40°C升至-10°C， 維持IOh ；板層溫度提高到28°C，維持8h。全程約28h。圖2 凍干曲線示意圖。2 :0 5°C進(jìn)箱；以每minl°C降至_40°C或以下，維持約4h ； 板層控制-10°c，維持14 16h ；每間隔2h升溫10°C，在28°C維持6h出箱。全程約28h。本發(fā)明所使用的凍融菌存率、凍干菌存率及活菌減少率計(jì)算方法凍融菌存率(％) = 化凍后每頭份(或每ml)活菌數(shù)/預(yù)凍前每頭份(或每ml)活菌數(shù)*100%
凍干菌存率(％) =凍干后每頭份(或每ml)活菌數(shù)/凍干前每頭份(或每ml)活菌數(shù)*100%
活菌減少率(%) =耐老化試驗(yàn)前每頭份(或每ml)活菌數(shù)一耐老化試驗(yàn)后每頭份(或每ml)活菌數(shù)/耐老化試驗(yàn)前每頭份(或每ml)活菌數(shù)*l00%實(shí)施例1將豬霍亂沙門氏菌(CVCC79500株)種子液按培養(yǎng)基總量的 2%接種于本發(fā) 明所提供的合成培養(yǎng)基(液體培養(yǎng)基)中，37°C發(fā)酵或通氣培養(yǎng)18 21h，培養(yǎng)過程中根 據(jù)需要加入適量消泡劑，并根據(jù)PH升高情況加入適量滅菌的40%葡萄糖以控制pH值。培 養(yǎng)結(jié)束后，3500r/min離心20min，去上清，菌泥立即加入經(jīng)過滅菌并預(yù)熱至37°C的本發(fā)明 提供的耐熱凍干保護(hù)劑，充分混勻后按規(guī)定頭份分裝。分裝過程中應(yīng)注意保溫振搖均勻，并 迅速進(jìn)行冷凍真空干燥，按《中國獸藥典》規(guī)定的方法、使用本發(fā)明提供的凍干曲線2(見圖 2)進(jìn)行，每頭份含活菌數(shù)應(yīng)不少于3X109CFU。實(shí)施例2將豬霍亂沙門氏菌(CVCC79500株)種子液按培養(yǎng)基總量的 2%接種于普通 肉湯培養(yǎng)基(《中國獸藥典》記載的配方)中，37°C發(fā)酵或通氣培養(yǎng)18 21h，培養(yǎng)過程中 根據(jù)需要加入適量消泡劑，并根據(jù)PH升高情況加入適量滅菌40%葡萄糖以控制pH值。培 養(yǎng)結(jié)束后，3500r/min離心20min，去上清，菌泥立即加入經(jīng)過滅菌并預(yù)熱至37°C的耐熱保 護(hù)劑，充分混勻后按規(guī)定頭份分裝。分裝過程中應(yīng)注意保溫振搖均勻，并迅速進(jìn)行冷凍真空 干燥，按《中國獸藥典》規(guī)定的方法、使用本發(fā)明提供的凍干曲線2(見圖2)進(jìn)行，每頭份含 活菌數(shù)應(yīng)不少于3X 109CFU。實(shí)施例3成品檢驗(yàn)性狀白色海綿狀疏松團(tuán)塊，易與瓶壁脫離，加稀釋液后迅速溶解。純粹檢驗(yàn)按《中國獸藥典》規(guī)定的方法進(jìn)行檢驗(yàn)，應(yīng)純粹。活菌計(jì)數(shù)按瓶簽注明頭份，用普通瓊脂平板做活菌計(jì)數(shù)(按《中國獸藥典》規(guī)定的 方法進(jìn)行)，每頭份含活菌數(shù)應(yīng)不少于3X 109CFU。安全檢驗(yàn)按瓶簽注明頭份，將疫苗用普通肉湯或蛋白胨水稀釋，皮下注射體重 1.5 2. Okg兔2只，各1.0ml(含2頭份)，觀察21日，應(yīng)存活。剩余水分測定按《中國獸藥典》規(guī)定的方法進(jìn)行測定，應(yīng)不超過4. 0%。真空度測定按《中國獸藥典》規(guī)定的方法進(jìn)行測定。貯藏與有效期2 8°C保存，有效期至少為18個(gè)月。實(shí)施例4耐熱保護(hù)劑配方及凍干曲線的篩選通過10種保護(hù)劑基質(zhì)的“凍融”試驗(yàn)和“凍干”試驗(yàn)，初步明確了各種保護(hù)劑基質(zhì) 的適用濃度，谷氨酸鈉(0.5%、2%)、蔗糖(5%、7.5%)凍融試驗(yàn)菌存率最高；1.5%明膠5%蔗糖保護(hù)劑中加入0.5% 199培養(yǎng)基或0.5%谷氨酸鈉可明顯提高凍干菌存率(均達(dá) 71%) ；1.5%明膠+5%蔗糖+5%山梨醇可使凍干菌存率達(dá)75%。1. 5%明膠、5%蔗糖中添 加0. 5% 2%谷氨酸鈉均有明顯提高菌體耐老化作用，使疫苗37°C保存7日的活菌減少率 分別為46 %、47 %和43 %、48 %，而明膠蔗糖對(duì)照為65 %。據(jù)此設(shè)計(jì)了 4種耐熱保護(hù)劑配方 1、2、3和4，與豬霍亂沙門氏菌菌液等量混合，分別用凍干曲線1、2進(jìn)行凍干，結(jié)果表明耐熱 保護(hù)劑配方1及凍干曲線2凍干效果最好。為了提高目前我國仔豬副傷寒活疫苗的菌存率，并方便疫苗的保存及運(yùn)輸，我們 進(jìn)行了該疫苗耐熱保護(hù)劑研究，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。1 材料1. 1豬霍亂沙門氏菌(CVCC79500株)(2006. 8. 29凍干，0. 3ml/支)，由中國獸醫(yī)藥 品監(jiān)察所提供。1. 2仔豬副傷寒合成培養(yǎng)基(批號(hào)0102)由本發(fā)明人提供及配制。1. 3保護(hù)劑基質(zhì)水溶性明膠(批號(hào)115K0144)購自Sigma公司；PVP購自BASF公司；199培養(yǎng)基 (批號(hào)282288)購自GIBCO公司；甘露醇、山梨醇、蔗糖、海藻糖、谷氨酸鈉、磷酸二氫鉀、磷 酸氫二鉀均為分析純，進(jìn)口分裝，購自北京拜爾迪生物公司。1. 4 凍干機(jī)，Edwards 公司，Lyofle X 2. 0。2 方法2. 1豬霍亂沙門氏菌制苗用菌液制備種子液按《規(guī)程》進(jìn)行制備。將種子液按2%接種250ml合成培養(yǎng)基三角瓶6個(gè)， 置37°C、200r/min振蕩培養(yǎng)12h，菌液經(jīng)3500r/min離心20min，收集所有的沉淀菌體，用 200ml滅菌pH 7. 2磷酸鉀緩沖液(附錄1)懸浮，充分混勻后，作為制苗用菌液。2. 2凍融試驗(yàn)2. 2. 1保護(hù)劑配制2. 2. 1. 1大分子保護(hù)劑配制稱取明膠6g及PVP12g，分別用注射用水定容至100ml，配制成6%明膠及12% PVP 貯液，2MNa0H調(diào)整pH值至7. 2，116°C滅菌30min。然后各取5ml用等量滅菌pH7. 2磷酸鉀 緩沖液稀釋成3%明膠及6% PVP。2. 2. 1. 2小分子保護(hù)劑配制稱取甘露醇10g、山梨醇10g、蔗糖15g、海藻糖15g、谷氨酸鈉15g和199培養(yǎng)基 2g，分別用pH 7. 2磷酸鉀緩沖液(磷酸氫二鉀1. 25g、磷酸二氫鉀0. 52g溶解于IOOOml注 射用水中，116°C滅菌30min，pH值為7. 2)定容至100ml，0. 22 μ m濾膜過濾除菌。然后按上 法用滅菌PH 7. 2磷酸鉀緩沖液稀釋成使用濃度。2. 2. 2 凍融分別取2. 1項(xiàng)制備的菌液Iml與22種單基質(zhì)保護(hù)劑等量混合后(保護(hù)劑終濃度 如表1所示)，先置2 8°C 20min，后置_40°C冷凍保存4h。同時(shí)設(shè)不含保護(hù)劑基質(zhì)的磷 酸鉀緩沖液作對(duì)照。將各凍存菌液融化后，連同凍融前及對(duì)照樣品按《中國獸藥典》進(jìn)行活 菌計(jì)數(shù)，并計(jì)算凍干菌存率。2. 3凍干試驗(yàn)
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2. 3. 1保護(hù)劑配制按2. 2. 1項(xiàng)進(jìn)行。2. 3. 2凍干分別取2. 1項(xiàng)制備的菌液IOml與14種保護(hù)劑等量混合后(保護(hù)劑終 濃度如表2所示)，定量分裝(2ml/瓶)，按《中國獸藥典》附錄進(jìn)行凍干。同時(shí)設(shè)1. 5%明 膠5%蔗糖作對(duì)照。分別取凍干前、后以及凍干后置37°C保存7日樣品進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)。2. 4耐熱保護(hù)劑配方及凍干曲線優(yōu)化2. 4. 1保護(hù)劑配制依據(jù)凍融和凍干試驗(yàn)結(jié)果，將能夠提高凍干菌存率及疫苗耐老 化性能的保護(hù)劑基質(zhì)，設(shè)計(jì)成4組耐熱保護(hù)劑(分別標(biāo)記為配方1、2、3和4)，其配方及配制 方法見附錄3。2. 4. 2凍干分別取2. 1項(xiàng)制備的菌液50ml與4組保護(hù)劑等量混合后，定量分裝 (2ml/瓶)，按凍干曲線1及凍干曲線2進(jìn)行凍干。分別取凍干前、后以及凍干后置37°C保 存7日樣品進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)。通過比較結(jié)果選擇最佳耐熱保護(hù)劑和凍干曲線。2.結(jié)果2. 1凍融試驗(yàn)凍融試驗(yàn)結(jié)果見表1。表1凍融試驗(yàn)中活菌計(jì)數(shù)及菌存率結(jié)果 注凍融菌存率計(jì)算方法按本發(fā)明提供的計(jì)算方法計(jì)算(下同)。表1結(jié)果顯示，在10種單基質(zhì)中，谷氨酸鈉(0. 5%、2% )、蔗糖(5%、7. 5% )菌 存率最高，可達(dá)60%以上；海藻糖(5% )、甘露醇(5% )、明膠(1.5%、3% )、199培養(yǎng)基 (0. 5% )次之，菌存率達(dá)50% 60%。
2. 2凍干試驗(yàn)樣品凍干前后及耐老化試驗(yàn)檢測結(jié)果見表2。表2樣品凍干前后及耐老化試驗(yàn)檢測結(jié)果 注凍干后樣品及耐老化試驗(yàn)樣品用生理鹽水恢復(fù)至原量后進(jìn)行檢測，其凍干菌 存率及活菌減少率按本發(fā)明提供的計(jì)算方法計(jì)算(下同)。表2結(jié)果顯示，1. 5%明膠5%蔗糖保護(hù)劑中加入0. 5% 199培養(yǎng)基或0. 5%谷氨酸 鈉可明顯提高凍干菌存率(均達(dá)71%) ；1.5%明膠+5%蔗糖+5%山梨醇可使凍干菌存率 達(dá)75 %。1. 5 %明膠、5 %蔗糖中添加0. 5 %、2 %谷氨酸鈉均有明顯提高菌體耐老化作用，使 疫苗37°C保存7日的活菌減少率分別為43%、48%。另外PVP (0. 1%)、199培養(yǎng)基(0.5%) 也有一定提高菌存率及耐老化作用。2. 3耐熱保護(hù)劑及凍干曲線優(yōu)化不同保護(hù)劑配方及凍干曲線的凍干結(jié)果見表3。表3不同保護(hù)劑配方及凍干曲線的凍干結(jié)果(活菌數(shù)108CFU/ml) 表3結(jié)果顯示，采用耐熱保護(hù)劑配方1與凍干曲線2凍干豬霍亂沙門氏菌 (CVCC79500株)效果最好，凍干后不結(jié)晶，凍干菌存率達(dá)86. 9% ；37°C保存7日不萎縮，活 菌減少率為15.0%。明顯優(yōu)于明膠蔗糖對(duì)照(其凍干菌存率為63.0%與55. ；37°C保 存7日后活菌減少率為71. 7%與68. 8% )。3小結(jié)與討論3. 1采用耐熱保護(hù)劑配方1與凍干曲線2凍干豬霍亂沙門氏菌(CVCC79500株)效
果良好。3. 2某些單保護(hù)劑基質(zhì)(如0. 5%和2%谷氨酸鈉、5%和7. 5%蔗糖、5%海藻糖、 5%甘露醇、1. 5%和3%明膠、0. 5% 199培養(yǎng)基)可以提高豬霍亂沙門氏菌(CVCC79500 株)在“凍結(jié)-解凍”的活性恢復(fù)率，可能是由于它們含有的糖醇羥基、或某些氨基酸成 分和菌膜表面的氨基基團(tuán)發(fā)生類似水合反應(yīng)，形成范德華表面張力，減少了冰晶對(duì)菌體 損傷° Scott (Scott, W. J. , In Recent Resear in Freezing and Drying. 1960,188 202. ) > Cho and Obayashi(Cho, CandObayashi, Y. , Bulletion of the World Health Orgination. 1956，14 :657.)曾報(bào)導(dǎo)使用谷氨酸鈉，在冷凍干燥過程中對(duì)病毒囊膜起到同 樣作用。3. 3在明膠大分子中添加少量PVP，可以更好的發(fā)揮保護(hù)劑與填充劑作用，因?yàn)?PVP可以抑制凍干過程中系統(tǒng)PH值降低(華澤釗.冷凍干燥新技術(shù).北京科學(xué)出版社， 2006. 1.)。3. 4該耐熱保護(hù)劑中大分子物質(zhì)主要形成耐熱框架，形成間接的隔熱層；小分子 物質(zhì)主要與菌體形成懸液，起直接作用。實(shí)施例5凍干保護(hù)劑使用方法
用耐熱保護(hù)劑將離心后菌體重懸浮成不同菌液濃度進(jìn)行配苗，結(jié)果，菌液濃度 100. 3X IO8 312X108CFU/ml，凍干菌存率達(dá)75. 7% 89. 8%，37°C保存7日后活菌減少 率為13% 18%，優(yōu)于其它濃度范圍。耐熱保護(hù)劑與菌液感作時(shí)間試驗(yàn)表明，2 8°C作 用24h，凍干菌存率達(dá)85. 3% 93. 1%，高于其它作用時(shí)間。7ml西林瓶疫苗分裝量3ml或 4ml，其凍干菌存率與2ml基本一致，而且耐老化試驗(yàn)中活菌減少率比2ml下降3 8個(gè)百 分點(diǎn)。為了明確耐熱保護(hù)劑在使用中相關(guān)參數(shù)，進(jìn)行了配苗比例、保護(hù)劑感作時(shí)間以及 苗液分裝量比較試驗(yàn)?，F(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。1 材料1. 1豬霍亂沙門氏菌(CVCC79500株)，由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所鑒定、保管和供應(yīng)。1.2普通瓊脂(批號(hào)20090102)、普通肉湯培養(yǎng)基(批號(hào)20090102)、20%鋁膠生 理鹽水(批號(hào)20090102)，由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所培養(yǎng)基組供應(yīng)。1. 3仔豬副傷寒合成培養(yǎng)基、仔豬副傷寒耐熱保護(hù)劑，由本發(fā)明人配制。1. 4 凍干機(jī)，Edwards 公司，Lyofle X 2. 0。2 方法2. 1豬霍亂沙門氏菌制苗用菌液制備種子液按《中華人民共和國獸用生物制品規(guī)程(2000版)》(以下簡稱《規(guī)程》[1]) 進(jìn)行制備。將種子液按2%接種250ml合成培養(yǎng)基三角瓶6個(gè)，置37°C、200r/min振蕩培養(yǎng) 12h，菌液經(jīng)3500r/min離心20min，收集所有的沉淀菌體，用200ml滅菌磷酸鉀緩沖液(稱 取磷酸氫二鉀1. 25g、磷酸二氫鉀0. 52g溶解于IOOOml注射用水中，116°C滅菌30min，pH值 為7. 2)懸浮，充分混勻后，作為制苗用菌液。2. 2耐熱保護(hù)劑的配苗試驗(yàn)用適量預(yù)熱至37°C的耐熱保護(hù)劑懸浮制苗用菌液成3組不同濃度第1組菌液濃 度約 700 X IO8 900X 108CFU/ml ；第 2 組菌液濃度約 300 X IO8 400 X 108CFU/ml ；第 3 組 菌液濃度約100 X IO8 200 X 108CFU/ml。然后定量分裝(2ml/瓶)，每組70瓶，按凍干曲 線2進(jìn)行凍干。分別取凍干前、后，以及凍干后置37°C保存7日樣品進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)。試驗(yàn)共 進(jìn)行3次。2. 3耐熱保護(hù)劑與菌體感作時(shí)間的試驗(yàn)用耐熱保護(hù)劑將沉淀將制苗用菌液懸浮成200 X IO8 300X 108CFU/ml，置2 8°C感作0、24、48h，然后定量分裝(2ml/瓶)，每組70瓶，按凍干曲線2進(jìn)行凍干。分別取 凍干前、后以及凍干后置37°C保存7日樣品進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)。試驗(yàn)共進(jìn)行3次。2. 4耐熱保護(hù)劑活疫苗分裝量的比較試驗(yàn)將2. 3項(xiàng)3次試驗(yàn)半成品，分別以2ml、3ml、4ml量分裝，各分裝70瓶，按凍干曲線 2進(jìn)行凍干。分別取凍干前、后以及凍干后置37°C保存7日樣品進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)。3 結(jié)果3. 1耐熱保護(hù)劑配苗比例試驗(yàn)不同菌液濃度凍干比較結(jié)果見表4表4不同菌液濃度凍干比較結(jié)果 表4結(jié)果顯示，菌液濃度在100 X IO8 300 X 108CFU/ml，凍干菌存率高，而37°C保 存7日耐老化結(jié)果基本一致。因《規(guī)程》要求每頭份不少于3X109CFU/ml，考慮到疫苗的頭 份數(shù)，因而適宜菌液濃度為200 X IO8 400 X 108CFU/ml。3. 2耐熱保護(hù)劑與菌體感作時(shí)間試驗(yàn)結(jié)果見表5。表5保護(hù)劑與菌液感作時(shí)間比較試驗(yàn) 表5結(jié)果顯示，保護(hù)劑與菌液在2 8°C感作24h，凍干菌存率高于其它時(shí)間；而 37°C保存7日耐老化試驗(yàn)結(jié)果基本一致。3.3耐熱保護(hù)劑活疫苗分裝量比較試驗(yàn)結(jié)果見表6。表6疫苗分裝量比較試驗(yàn) 表6結(jié)果顯示，7ml西林瓶疫苗裝量3ml或4ml，其凍干菌存率與2ml基本一致，且 置37°C保存7日的活菌減少率相對(duì)降低3 8個(gè)百分點(diǎn)。4結(jié)論與討論4. 1配苗比例是影響耐熱保護(hù)劑作用的重要因素，菌液濃度高，保護(hù)劑分子有效保 護(hù)菌體的資源相對(duì)不足。通過比較試驗(yàn)，確定適宜配苗濃度為200X IO8 400X 108CFU/ml。4. 2適當(dāng)延長耐熱保護(hù)劑與菌液混合作用時(shí)間，有利于保護(hù)劑分子充分滲入菌體 內(nèi)，提高菌體的抗凍能力。但若細(xì)菌暴露在空氣中的時(shí)間過長，某些菌體體內(nèi)產(chǎn)生的過氧化 氫蓄積對(duì)菌體有毒害作用，造成死亡。耐熱保護(hù)劑與菌體感作時(shí)間結(jié)果表明，當(dāng)菌體與保護(hù) 劑2 8°C作用24h，其凍干菌存率最高，為85. 3% 93. 1 %，而耐老化試驗(yàn)結(jié)果基本一致 (活菌減少率達(dá)10% 20% )。4. 3充分利用西林瓶的空間，提高疫苗分裝量，是降低成本，提高疫苗頭份數(shù)的重 要手段，研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在7ml西林瓶中分裝量達(dá)3 4ml，其凍干菌存率與2ml分裝量基本 一致，而其耐老化結(jié)果中活菌減少率相對(duì)降低3 8個(gè)百分點(diǎn)，主要由于瓶中菌液的高度增 加，凍干過程中延長了冷凍時(shí)間、升華時(shí)間以及解析干燥時(shí)間。實(shí)施例6耐熱保護(hù)劑的應(yīng)用試驗(yàn)采用篩選出耐熱保護(hù)劑1及凍干曲線2試制仔豬副傷寒耐熱保護(hù)劑活疫苗 (CVCC79500株)3批。凍干后疫苗不結(jié)晶，37°C保存7日不萎縮，其純粹、活菌計(jì)數(shù)、安全性、 剩余水分和真空度均符合規(guī)定。凍干前活菌計(jì)數(shù)分別為5. 2X IO9CFU/頭份、6. 2X IO9CFU/ 頭份和5. 6X IO9CFU/頭份；凍干后活菌計(jì)數(shù)分別為4. 52X IO9CFU/頭份、5. 22X IO9CFU/頭 份和4. 76 X IO9CFU/頭份，凍干菌存率分別為87%、84%和85% ；置37°C保存7日，活菌計(jì) 數(shù)分別為3. 84 X IO9CFU/頭份、4. 36 X IO9CFU/頭份和4. OOX IO9CFU/頭份，活菌減少率分別 為15%、16.3%和15.9%，用37°C保存7日的耐熱保護(hù)劑活疫苗免疫兔，30日后攻毒均可 保護(hù)4/5 5/5，對(duì)照5/5死亡。運(yùn)用優(yōu)化的耐熱保護(hù)劑和凍干曲線試生產(chǎn)3批仔豬副傷寒耐熱保護(hù)劑活疫苗 (CVCC79500株)，參照《規(guī)程》進(jìn)行檢驗(yàn)，現(xiàn)將試驗(yàn)結(jié)果報(bào)告如下。1 材料1. 1仔豬副傷寒合成培養(yǎng)基及耐熱保護(hù)劑，本發(fā)明人配制及提供。
1.2 菌種生產(chǎn)用菌種為豬霍亂沙門氏菌(CVCC79500株)；檢驗(yàn)用菌種為豬霍亂沙門氏菌 (CVCC79102株)，均由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所鑒定、保管和供應(yīng)。1.3培養(yǎng)基普通瓊脂(批號(hào)0102)、普通肉湯培養(yǎng)基(批號(hào)0102)、20%鋁膠生理鹽水(批 號(hào)0102)、純粹檢驗(yàn)用硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基(T.G)、酪胨瓊脂(G.A)和葡萄糖蛋白胨湯(G.P) (批號(hào)0102)，由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所培養(yǎng)基組供應(yīng)。1.4 動(dòng)物小鼠ICR系，30 35日齡、體重18 22g，清潔級(jí)；大耳白兔體重1. 5 2. 0kg， 普通級(jí)；由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物組采購并提供。1. 5 凍干機(jī)，Edwards 公司，Lyofle X 2. 0。1. 6 水分測定儀，METTLER TOLEDO。1. 7真空度測定儀，76-1型高頻電火花真空度測定儀。2 方法2.1菌液制備及配苗種子液按《規(guī)程》[1]進(jìn)行制備。將種子液按2%接種250ml合成培養(yǎng)基三角瓶6 個(gè)，置37°C、200轉(zhuǎn)/分振蕩培養(yǎng)12h，菌液經(jīng)3500轉(zhuǎn)/分離心20min，棄去培養(yǎng)液，菌體沉 淀換以250ml耐熱保護(hù)劑懸浮混勻，取樣進(jìn)行半成品檢驗(yàn)(活菌計(jì)數(shù)及純粹檢驗(yàn))，懸浮菌 液置2 8°C保存24h。2. 2 凍干待半成品檢驗(yàn)合格，定量分裝(3ml/瓶)。按凍干曲線2進(jìn)行凍干。試生產(chǎn)3批仔 豬副傷寒耐熱保護(hù)劑活疫苗(CVCC79500株)。2. 3 檢驗(yàn)2. 3. 1按《規(guī)程》進(jìn)行性狀、純粹、活菌計(jì)數(shù)、安全性、剩余水分和真空度等檢驗(yàn)。2. 3. 2耐老化試驗(yàn)將實(shí)驗(yàn)室制備的3批疫苗，每批隨機(jī)抽取疫苗8瓶，其中3瓶分別進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)， 以其平均數(shù)作為耐老化試驗(yàn)前的活菌數(shù)標(biāo)準(zhǔn)。另5瓶置37°C保存7日，任取其中3瓶，分別 按上述方法進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)。然后計(jì)算疫苗的活菌減少率。2. 3. 3效力試驗(yàn)從37°C保存7日的3批疫苗中，每批隨機(jī)抽取疫苗5瓶，按瓶簽注明頭份，注射組 用20%鋁膠生理鹽水混合稀釋成1頭份/ml ；灌服組用生理鹽水混合稀釋成1頭份/2ml ； 大腿內(nèi)側(cè)肌肉注射和經(jīng)口灌服體重1. 5 2. OKg家兔各5只，1頭份/只，30日后，連同條 件相同的不接種對(duì)照兔5只，各皮下注射經(jīng)肉肝胃(膜)消化湯培養(yǎng)2代的豬霍亂沙門氏 菌(CVCC79102株)菌液1. Oml (含3MLD的活菌)，觀察30日，記錄存活情況。3 結(jié)果3. 1菌液制備結(jié)果見表7。表7菌液制備及半成品檢驗(yàn)結(jié)果
3.2疫苗檢驗(yàn)結(jié)果見表8、表9、表10。
表8仔豬副傷寒耐熱保護(hù)劑活疫苗檢驗(yàn)結(jié)果(一) 表9仔豬副傷寒耐熱保護(hù)劑活疫苗檢驗(yàn)結(jié)果(二) 表8、9結(jié)果顯示，3批仔豬副傷寒耐熱保護(hù)劑活疫苗純粹，性狀、剩余水分、真空 度、安全檢驗(yàn)符合《規(guī)程》要求。表10疫苗凍干前后活菌數(shù)及耐老化試驗(yàn)結(jié)果 表10結(jié)果顯示，3批耐熱活疫苗凍干菌存率達(dá)80%以上(分別為87%、84%及 85% ) ；37 保存7日，活菌減少率低于20% (分別為15%、16. 3%及15. 9% )。
3. 3效力試驗(yàn)結(jié)果見表11。表11 3批耐熱保護(hù)劑疫苗家兔效力檢驗(yàn)結(jié)果 表11中顯示，3批耐熱保護(hù)劑活疫苗37°C保存7日后，以1頭份口服及肌肉注射 免疫家兔攻毒均可保護(hù)4/5 5/5，效力確實(shí)。4 結(jié)論耐熱凍干保護(hù)劑1和凍干曲線2，適用于仔豬副傷寒耐熱保護(hù)劑活疫苗 (CVCC79500株)的生產(chǎn)。實(shí)施例7耐熱保護(hù)劑保存期試驗(yàn)將3批耐熱保護(hù)劑置2 8°C保存0日、10日、20日、30日和40日，分別制備凍干 疫苗，測定其凍干菌存率及凍干后置37°C保存7日耐老化試驗(yàn)的活菌減少率。結(jié)果保存40 日的耐熱保護(hù)劑制備的疫苗凍干菌存率為83. 7% 87. 5%，置37°C保存7日耐老化試驗(yàn)活 菌減少率為12.6% 17. 1%，與新鮮配制的保護(hù)劑(制備的疫苗凍干菌存率達(dá)82. 9% 87. 0%，37°C保存7日耐老化試驗(yàn)活菌減少率為15. 0% 16. 3% )結(jié)果基本一致。為確保 效果，耐熱保護(hù)劑2 8°C有效期定為30日。1 材料1. 1耐熱保護(hù)劑3批，批號(hào)分別為0101、0115、0210，由本發(fā)明人提供及配制。1. 2生產(chǎn)用菌種為豬霍亂沙門氏菌(CVCC79500株)由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所鑒定、
保管和供應(yīng)。1. 3 凍干機(jī)，Edwards 公司 Lyofle X 2. 0。1.4普通瓊脂(批號(hào)0102)、普通肉湯培養(yǎng)基(批號(hào)0102)由本發(fā)明人制備供應(yīng)。2 方法2. 1耐熱保護(hù)劑保存溫度及時(shí)間將本發(fā)明人按本法制備的3批配制好耐熱保護(hù)劑，批號(hào)分別為01、02、03，每批 1000ml，置2 8°C保存40日，并在0日、10日、20日、30日及40日等時(shí)間階段分別取樣 50ml。2. 2菌液制備、配苗及凍干
2. 2. 1種子液按《規(guī)程》方法進(jìn)行制備。然后按2%接種500ml合成培養(yǎng)基三角瓶 6個(gè)(裝量250ml/瓶)，37°C、200r/min振蕩培養(yǎng)12h，菌液經(jīng)3500r/min離心20min后，菌 體沉淀用200ml滅菌pH 7. 2磷酸鉀緩沖液懸浮混勻，作為菌液。2. 2. 2將50ml耐熱保護(hù)劑樣品，各加入50ml抗原液，充分混勻后，定量分裝(3ml/ 瓶)，按凍干曲線2進(jìn)行凍干。2. 3活菌計(jì)數(shù)分別取凍干前、后以及凍干后置37°C保存7日樣品進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)。3 結(jié)果3批耐熱保護(hù)劑的保存期試驗(yàn)結(jié)果見表12。表12耐熱保護(hù)劑的保存期試驗(yàn)結(jié)果 結(jié)果顯示，3批耐熱保護(hù)劑置2 8°C保存40日凍干菌存率為83. 7% 87. 5%， 置37°C保存7日活菌減少率為12. 6% 17. 1 %，與保存前的結(jié)果基本一致(凍干菌存率為 82. 9% 87% ；活菌減少率為15% 16. 3% )。4 結(jié)論因耐熱保護(hù)劑置2 8°C保存40日與保存前的凍干菌存率、活菌減少率結(jié)果基本 一致。為確保效果，將耐熱保護(hù)劑2 8 有效期定為30日。實(shí)施例8與同類產(chǎn)品的比較研究報(bào)告仔豬副傷寒耐熱保護(hù)劑活疫苗(01、02和03)與常規(guī)仔豬副傷寒活疫苗(0205、 0306和0912)，進(jìn)行凍干菌存率、37°C保存7日耐老化試驗(yàn)、安全和效力試驗(yàn)比較。結(jié)果 3批耐熱保護(hù)劑活疫苗凍干菌存率分別為87 %、84 %和85 %，而常規(guī)疫苗為52 %、57 %和 60% ；37°C保存7日耐老化試驗(yàn)，耐熱保護(hù)劑活疫苗活菌減少率為15%、16%和18%，而常 規(guī)疫苗為75%、67%和73%;安全試驗(yàn)中，常規(guī)疫苗1 2日內(nèi)分別有1/5、2/5和1/5頭出現(xiàn)體溫升高、減食等過敏癥狀，然后自行恢復(fù)，耐熱保護(hù)劑活疫苗均無不良反應(yīng)，而口服免 疫兩者均無不良反應(yīng)；效力試驗(yàn)中，兩者攻毒保護(hù)結(jié)果基本一致。1 材料1.1 疫苗仔豬副傷寒耐熱保護(hù)劑活疫苗(CVCC79500株)，批號(hào)分別為01、02和03，均為15
頭份/瓶，由北京海淀中海動(dòng)物保健科技公司實(shí)驗(yàn)室制備。仔豬副傷寒活疫苗(以下簡稱“常規(guī)疫苗”)，批號(hào)分別為0205、0306和0912，均為 15頭份/瓶，由吉林正業(yè)塵物制品有限公司提供。1. 2檢驗(yàn)用豬霍亂沙門氏菌(CVCC79102株)，由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所鑒定、保管和提供。1. 3仔豬30日齡、體重12kg以上、斷乳，普通級(jí)，由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 組采購和提供。2 方法2. 1凍干菌存率及耐老化試驗(yàn)分別按各自《規(guī)程》制備仔豬副傷寒常規(guī)疫苗3批(01、02和03)和仔豬副傷寒耐 熱保護(hù)劑活疫苗3批(0205、0306和0912)。各取凍干前和后、37°C保存7日樣品按現(xiàn)行《中 國獸藥典》附錄進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)。2. 2安全檢驗(yàn)取耐熱保護(hù)劑活疫苗和常規(guī)疫苗各3批，每批10瓶，按瓶簽注明頭份，其中5瓶用 生理鹽水混合稀釋至2頭份/5. 0ml，灌服仔豬5頭，每頭5. 0ml，共30頭；另5瓶用20%氫 氧化鋁膠生理鹽水混合稀釋至2頭份/ml，耳后淺層肌肉注射仔豬5頭，每頭1. 0ml，共30 頭。同時(shí)設(shè)5頭不免疫仔豬對(duì)照，隔離飼養(yǎng)，觀察21日，記錄仔豬的采食、飲水和體溫情況。2. 3效力檢驗(yàn)取耐熱保護(hù)劑活疫苗和常規(guī)疫苗各3批，每批10瓶，按瓶簽注明頭份，其中5瓶用 生理鹽水混合稀釋至1頭份/5. 0ml，灌服仔豬5頭，每頭5. 0ml，共30頭；另5瓶用20%氫 氧化鋁膠生理鹽水混合稀釋至1頭份/ml，耳后淺層肌肉注射仔豬5頭，每頭1. 0ml，共30 頭；同時(shí)設(shè)立5頭不免疫仔豬對(duì)照。在免疫后30日，各靜脈注射經(jīng)肉肝胃(膜)消化湯培 養(yǎng)2代的豬霍亂沙門氏菌(CVCC79102株)菌液2. Oml (含IMLD活菌)。隔離飼養(yǎng)，觀察21 日，記錄仔豬的存活情況。3 結(jié)果3. 1凍干菌存率及耐老化試驗(yàn)結(jié)果見表13表13 3批實(shí)驗(yàn)室制品與常規(guī)疫苗的凍干菌存率及耐老化試驗(yàn)比較結(jié)果 *表中凍干后及耐老化試驗(yàn)樣品用生理鹽水恢復(fù)至原量后進(jìn)行檢測，凍干菌存率 及活菌減少率計(jì)算按本發(fā)明提供的方法進(jìn)行。表13顯示，耐熱保護(hù)劑活疫苗的凍干菌存率為84% 87% ；常規(guī)疫苗為52% 60% ；37 保存7日，耐熱保護(hù)劑活疫苗的活菌減少率為15% 18% ；常規(guī)疫苗為67% 75%。3. 2安全檢驗(yàn) 表14顯示，耐熱保護(hù)劑活疫苗以2頭份肌肉接種仔豬，其采食、飲水、體溫均正常。
19 表15顯示，3批耐熱保護(hù)劑活疫苗與常規(guī)疫苗以1頭份口服及肌肉注射免疫仔豬， 攻毒均可保護(hù)4/5 5/5，無顯著差異。4 結(jié)論通過比較試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)耐熱保護(hù)劑活疫苗與已有的仔豬副傷寒活疫苗相比，凍干菌 存率高(達(dá)84% 87% ) ；37°C保存7日的活菌減少率低(達(dá)15% 18% )；其過敏反應(yīng) 低；兩者效力檢驗(yàn)結(jié)果一致。
而常規(guī)疫苗肌肉注射后1 2日部分豬出現(xiàn)體溫升高、減食等過敏癥狀，但可自行恢復(fù)；口 服免疫豬，兩者結(jié)果一致，均無不良反應(yīng)。3. 3效力檢驗(yàn)表15 3批耐熱保護(hù)劑疫苗與常規(guī)疫苗的效力檢驗(yàn)結(jié)果
護(hù)況 保情
觀間} 毒時(shí)日 攻察<
攻毒途徑弓劑量
觀間} 疫時(shí)H 免察C
疫量 免劑
疫徑 免途
豬數(shù)量 (頭)
批號(hào)
權(quán)利要求
一種仔豬副傷寒活疫苗，其特征是該疫苗含有豬霍亂沙門氏菌CVCC79500株及水溶性明膠、PVP、山梨醇、蔗糖、199培養(yǎng)基、L 谷氨酸鈉、磷酸氫二鉀及磷酸二氫鉀組成的耐熱凍干保護(hù)劑。
2.一種仔豬副傷寒活疫苗的生產(chǎn)方法，其特征是將種子液按培養(yǎng)基總量的 2% 接種于普通肉湯或本發(fā)明提供的液體合成培養(yǎng)基中，37°C發(fā)酵或通氣培養(yǎng)18 21h，培養(yǎng) 過程中根據(jù)需要加入適量消泡劑，并根據(jù)PH升高情況加入適量滅菌40%葡萄糖以控制pH 值；培養(yǎng)結(jié)束后，3500r/min離心20min，去上清，菌泥立即加入經(jīng)過滅菌并預(yù)熱至37°C的耐 熱凍干保護(hù)劑，充分混勻，分裝后經(jīng)冷凍真空干燥而成，每頭份活菌數(shù)不少于3X 109CFU。
3.按照權(quán)利要求1和2所述的仔豬副傷寒活疫苗及其生產(chǎn)方法，其特征是其中所使用 耐熱凍干保護(hù)劑的最佳配方是水溶性明膠10g，PVP lg,山梨醇50g，蔗糖50g，199培養(yǎng)基 5g, L-谷氨酸鈉5g，磷酸氫二鉀1. 25g，磷酸二氫鉀0. 52g，注射用水1000ml。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種仔豬副傷寒活疫苗的生產(chǎn)方法。在本發(fā)明提供的生產(chǎn)方法中采用了合成培養(yǎng)基和耐熱凍干保護(hù)劑及其相適應(yīng)的凍干曲線一整套技術(shù)，提高豬霍亂沙門氏菌CVCC79500株培養(yǎng)菌數(shù)，保證批次間穩(wěn)定性，減少凍干過程的損失率，降低菌體死亡和代謝副產(chǎn)物產(chǎn)生的過敏反應(yīng)，將成品疫苗的保存溫度提高到2～8℃，有效期達(dá)到18～24個(gè)月，并可實(shí)現(xiàn)較高溫度短期保存(37℃保存7日，活菌減少率低于20％)。
文檔編號(hào)A61K47/42GK101912608SQ20101025459
公開日2010年12月15日 申請(qǐng)日期2010年8月17日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月17日
發(fā)明者劉延亭, 孫曄, 朱良全, 王棟 申請(qǐng)人:北京海淀中海動(dòng)物保健科技公司