專利名稱：表達(dá)禽腦脊髓炎病毒vp1蛋白重組菌的構(gòu)建的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及表達(dá)禽腦脊髓炎病毒VPl蛋白重組菌的構(gòu)建，屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域， 也屬于獸用生物制品領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
禽腦脊髓炎又稱流行性震顫，是由禽腦脊髓炎病毒(Avian Encephalomyelitis Virus, AEV)引起的一種主要侵害雛雞的傳染病，其特征性病理變化為非化膿性腦脊髓炎， 典型癥狀為運(yùn)動失調(diào)，頭頸震顫和漸進(jìn)性麻痹(趙振華、禹旺盛、郝憲譜等.禽腦脊髓炎的發(fā)生與診斷.內(nèi)蒙古畜牧科學(xué).1994，3 :34-37)。世界幾乎所有飼養(yǎng)商品雞的地區(qū)都發(fā)生過該病，我國自上世紀(jì)80年代以來各地陸續(xù)暴發(fā)此病，給養(yǎng)禽業(yè)帶來較大的經(jīng)濟(jì)損失。由于本病具有突然出現(xiàn)，難以預(yù)測持續(xù)期，可通過水平接觸和垂直傳播等特點(diǎn)，所以對養(yǎng)禽業(yè)的危害非常嚴(yán)重，唯一有效辦法是通過對產(chǎn)蛋種雞接種疫苗來預(yù)防后代雛雞的發(fā)病。目前國內(nèi)對禽腦脊髓炎疫苗的研究大多集中在滅活疫苗的研制，國外為弱毒活疫苗的研究報道。AEV是小RNA科腸病毒屬成員，基因組為單鏈正股RNA(Calnek，B. ff.，Luginbuhl， R. E.，Helmboldt, C. F. ,1997.Avian encephalomyelitis diseases of Poultry. Iowa State University Press，Ames，IA，pp. 571-581) AEV 僅有一個翻譯起點(diǎn)，編碼產(chǎn)生一個多聚蛋白，多聚蛋白在病毒編碼的活性蛋白的作用下，級聯(lián)水解成功能性蛋白，VPl是病毒的四種結(jié)構(gòu)蛋白中的一種，與病毒的侵入及參與構(gòu)成病毒的抗原成分有關(guān)。新加坡的Li Wei (2008)最近報道用細(xì)胞表達(dá)的VPl亞單位疫苗能有效地保護(hù)雞免受AEV的感染。他們將AEV的主要抗原蛋白VPl、VP0、VP3分別在細(xì)胞SF9中進(jìn)行表達(dá)，然后純化蛋白，制成亞單位疫苗，并對VPUVPO和VP3生物活性進(jìn)行了檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)VP1是主要的抗原蛋白，能有效地保護(hù)雞免受 AEV 的感染(Wei L, Chee LL, Wei T et al. The VPl protein of avian encephalomyelitis virus is a major host-protective immunogen that serves as diagnostic potential. J Virol Methods. 2008Apr ; 149 (I) :56-62.)。完整的病原體含有許多抗原，但并非所有抗原都能刺激宿主產(chǎn)生保護(hù)性應(yīng)答。其中某些抗原還能引起過敏，免疫抑制和其他副作用，這是使用完整的病原體做疫苗的缺陷。 并且目前國內(nèi)應(yīng)用的滅活苗生產(chǎn)制備抗原過程繁瑣，而弱毒疫苗現(xiàn)也有接種疫苗發(fā)病情況存在。而用亞單位疫苗則可以解決這個問題，尤其是這種疫苗除了具有抗原穩(wěn)定性高，純度高，特異性強(qiáng)，敏感性高，不產(chǎn)生其他不相關(guān)抗體，免疫效果檢測方法方便準(zhǔn)確外，還十分易于生產(chǎn)。不用動物體或是胚體生產(chǎn)，不會帶有組織殘留物。而且不需滅活，但安全性高。通過對禽腦脊髓炎病毒VPl cDNA全序列進(jìn)行篩選和分析，選取了其中一段抗原表位較豐富、能夠在原核細(xì)胞中高效表達(dá)的cDNA序列，構(gòu)建了原核表達(dá)載體，進(jìn)行原核表達(dá)， 并成功地表達(dá)出可溶性的重組蛋白。利用本發(fā)明可以生產(chǎn)出禽腦脊髓炎亞單位疫苗，具有商業(yè)使用價值
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種能表達(dá)禽腦脊髓炎病毒VPl蛋白重組菌的構(gòu)建，得到的重組菌，以求為大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)禽腦脊髓炎病毒VPl蛋白亞單位疫苗提供生產(chǎn)用菌株。I.禽腦脊髓炎病毒VPl重組菌的構(gòu)建本發(fā)明設(shè)計合成了能生產(chǎn)禽腦脊髓炎VPl蛋白的基因，這種基因含有如下核苷酸序列(序列I)5'
GAGGACAAGG AGTTGGCGAG TATGGATCTG CAGTACACAT TAAGTCTTTT CGGCATTGTA ACGTTGAACT GGATCCCTTT GGCAATTACA TTTAATGAAG GCAAGACAGT CGATGAAATT
-ATGGGGAAAG AGGATGAAGGI AGGATTTTCCAGTGTGCCTGAAGTGGAGCAACATGTTGTTAACCACAGGGACCTTTGCACGTGACACCTTTTGGCGCTGTTAAAGCCATGGAGGACCCTCGAAAACACCTGGTACATTTCCTGAATTAGCTCCTGGTAAACCTCGACACACAGTAGACCATATAAGTTTATGGGGCGTGCCCATTACTTGTGGGGACATAAATTTACCAAAACTGATATGTCCAGATACCATTGAGTCCCATCAAGGAGGGTTTTGTGACGGGAACGCTTAGGTGGTTTTCCAATTGTATCGTGGTTCTCTCGACATTACCATGACATTCGCAGGAAAGACTAATGTAGATACTTTGTGCCTGAGGGTGTTGCGATAGAGACTGAGAGGAAGGAACAGACCCCTCTGCTCACAAAACATCGGTAGGTGCCATTAGGTTTAATACTGGACAAACTACAAATGTCCAGTTTACTACACGCCACTGGAGCACATCGCAACCCATTCTAAAAACGCGATGGACTCAGTCTTGGGACTCAGATCACCAATTATAGTGCTCAGGATGAGTACCTGCAGGTCACCTACTATATCAGCATTCACAGTTTTCTGTTCCCAGAGCGGTACCAGTGGTTAGCTCATTCACTGACACATCTAGATGAATACATATTGGCTCGATGATGACGAGTTGGTGGAAGGGTCCTCCCATTTTAGTTTGAGGAGGCCCAATGTTAA-3'MetGlyLysGluAspGluGlyGlyPheSerSerValProGluValGlu
GlnHisValValGluAspLysGluProGlnGlyProLeuHisValThr
ProPheGlyAlaValLysAlaMetGlu AspProGlnLeuAlaArg Lys
ThrProGlyThrPheProGluLeuAsp ProGlyLysProArgHisThr
ValAspHisMetAsp Leu Tyr Lys Phe Met Gly Arg Ala His Tys Leu
TrpGlyHisLysPheThrLysThrAspMetGlnTyrThePheGlnHe
ProLeuSerProHeLysGluGlyPheValThrGlyThrLeuArgTrp
PheLeuSerLeuPheGlnLeuTyrArgGlySerLeuAspHeThrMet
ThrPheAlaGlyLysThrAsnValAspGlyHeValTyrPheValPro
GluGlyValAlaHeGluThrGluArgLysGluGlnThrProLeuLeu
ThrLeuAsnTyrLysThrSerValGlyAlaHeArgPheAsnThrGly
GlnThrThrAsnValGlnPheArgHeProPheTyrThrProLeuGlu
HisHeAlaThrHisSerLysAsnAlaMetAspSerValLeuGlyAla
HeThrThrGlnHeThrAsnTyrSerAlaGlnAspGluTyrLeuGln
ValThrTyrTyrHeSerPheAsnGluAspSerGlnPheSerValPro
ArgAlaValProValValSerSerPheThrAspThrSerSerLyrThr
ValMetAsnThrTyrTrpLeuAspAspAspGluLeuValGluGlySer
SerHisPheSerPheAspGluHeGluGluAlaGlnCys
為擴(kuò)增如上所述的基因，本發(fā)明設(shè)計并合成了如下相應(yīng)引物 primer 1:5' -GGGGAATTCATGGGGAAAGAGGATGAAGGAGGA-3,(序列 3)
primer 2:5' -GGGGTCGACTTAACATTGGGCCTCCTCAATTTC-3'(序列 4)將含有如上所述核苷酸序列的基因(禽腦脊髓炎VPl蛋白基因)連入克隆載體 PM-18T，并轉(zhuǎn)入大腸埃希氏菌DH5 α。將鑒定正確的陽性質(zhì)粒pMD18_T_VPl，用ECORI和Sal I 雙酶切后，經(jīng)I. 2%瓊脂糖凝膠電泳，回收到VPl基因?；厥盏腣Pl基因連入pET-32a，構(gòu)建成禽腦脊髓炎VPl蛋白基因的表達(dá)質(zhì)粒pET-32a-VPl，轉(zhuǎn)化表達(dá)型大腸埃希氏菌Rossetta， 獲得可表達(dá)禽腦脊髓炎VPl蛋白的基因工程大腸埃希氏菌。表達(dá)載體pET_32a(+)帶有高效表達(dá)的T7啟動子，受噬菌體T7強(qiáng)轉(zhuǎn)錄及翻譯信號控制，能在乳糖的作用下，由宿主菌提供的T7RNA聚合酶進(jìn)行誘導(dǎo)。構(gòu)建的禽腦脊髓炎VPl蛋白表達(dá)質(zhì)粒pET-32a_VPl，轉(zhuǎn)化表達(dá)型大腸埃希氏菌(Escherichia coli) Rossetta(購自博邁德公司)后構(gòu)建成重組大腸埃希氏菌(Escherichia coli)Rossetta/ pET-32a-VPl (該菌株已于2011年12月13日送北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號中國科學(xué)院中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為；CGMCC No. 5581)加入
0.2mmol/L乳糖溶液的誘導(dǎo)劑，使禽腦脊髓炎VPl蛋白獲得高效表達(dá)。2.表達(dá)產(chǎn)物的制備(I)發(fā)酵及誘導(dǎo)表達(dá)將本發(fā)明中重組大腸埃希氏菌(Escherichia coii)Rossetta/pET-32a_VPl接種于含有氨芐青霉素和氯霉素的LB平板上，37°C培養(yǎng)過夜。挑取菌落，在含有氨芐青霉素和氯霉素的LB培養(yǎng)液和大腸埃希氏菌培養(yǎng)基(配方為胰蛋白胨1%，酵母提取物0.5%，氯化鈉I % )中培養(yǎng)至菌液0D600為0. 6 0. 8時，加入終濃度為0. 02M的乳糖，25 37°C進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)5 7h,然后4°C, 5000rpm離心5min,收集菌體。用PBS重懸浮菌體。(2)表達(dá)產(chǎn)物的鑒定將PBS重懸浮的菌體用超聲波裂解后，12000r/min離心15min，取上清加入蛋白電泳上樣緩沖液(購自北京博邁德科技發(fā)展有限公司)，沸水煮8min后，用12%的分離膠進(jìn)行SDS-PAGE鑒定(圖5中，從左到右分別是蛋白marker，對照，全菌-1，全菌_2)。采用硫酸銨沉淀(每IOOml上清加5. 6g硫酸銨，4°C過夜,然后10000r/min離心IOmin,收集沉淀， 用IOmlPBS (pH7. 2)進(jìn)行懸浮)、Ni_NTA對上清液進(jìn)行純化(見附注I)。將用Ni-NTA純化的產(chǎn)物進(jìn)行SDS-PAGE分析(圖6，從左到右分別是洗脫液洗脫下的第一管、第二管和第三管)。(3)重組蛋白的抗原活性檢測(參考圖7)將上述Ni-NTA親和層析純化得到的蛋白上清加入到等量的弗氏佐劑(購于sigma 公司)中制備亞單位疫苗。取I. 5mL對2月齡的試驗(yàn)兔多點(diǎn)皮下注射免疫，在首免后28d， 56d分別用弗氏不完全佐劑(購于sigma公司)和純化蛋白制成的油乳劑疫苗加強(qiáng)免疫，第三次免疫7d后收集血清，用瓊脂擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)檢測抗血清的活性。(圖7中，1、7為純化的VPl 蛋白；2、4、6為免疫后的兔血清；3、5為表達(dá)菌株Rossetta破碎后的上清-陰性對照)(4)表達(dá)蛋白的純化過程將收集的菌體用生理鹽水進(jìn)行懸浮，置超聲波破碎菌體。加固體硫酸銨至濃度達(dá)到10%，充分溶解后4°C存放過夜。離心收集沉淀。用生理鹽水重溶沉淀，并用透析袋(北京瑞達(dá)恒輝科技發(fā)展有限公司生產(chǎn)，截留量14KD)進(jìn)行透析。用 AGP法(張淑霞，楊增岐.禽腦脊髓炎瓊擴(kuò)抗原的研制和應(yīng)用.動物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2001，22 (2) 59-60)測定回收物抗原滴度。
3.本發(fā)明所涉及重組菌表達(dá)產(chǎn)物制備的疫苗與其他疫苗的比較見表I。表I本發(fā)明所涉及的疫苗與現(xiàn)在使用的疫苗比較
權(quán)利要求
1.一種表達(dá)禽腦脊髓炎VPl蛋白重組菌的構(gòu)建，其特征在于該重組菌是將含有所禽腦脊髓炎VPl蛋白基因(序列I)連入克隆載體PM-18T，并轉(zhuǎn)入大腸埃希氏菌DH5a ;將鑒定正確的陽性質(zhì)粒，PMD18-T-VP1用ECORI和SalI雙酶切后，經(jīng)I. 2%瓊脂糖凝膠電泳，回收到VPl基因；回收的VPl基因連入pET-32a，構(gòu)建成禽腦脊髓炎VPl蛋白基因的表達(dá)載體 pET-32a_VPl，轉(zhuǎn)化表達(dá)型大腸桿菌Rossetta，獲得可表達(dá)禽腦脊髓炎VPl蛋白的基因工程大腸埃希氏菌pET-32a-VPl/Rossetta株，該菌株已于2011年12月13日送交北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號中國科學(xué)院微生物研究所中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏編號為CGMCC No. 5581。
2.一種由權(quán)利要求I構(gòu)建成的表達(dá)禽腦脊髓炎VPl蛋白重組菌重組菌所制備的禽腦脊髓炎病毒VPl蛋白亞單位疫苗，其特征在于該亞單位疫苗含有大腸埃希氏菌CGMCC No. 5581表達(dá)的腦脊髓炎VPl蛋白和常規(guī)礦物油佐劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種表達(dá)禽腦脊髓炎病毒VP1蛋白重組菌的構(gòu)建。本發(fā)明通過合成了禽腦脊髓炎VP1基因的引物，構(gòu)建了帶有該基因的高效表達(dá)載體的重組菌，實(shí)現(xiàn)了禽腦脊髓炎VP1蛋白在大腸桿菌中的高效表達(dá)，可溶性蛋白表達(dá)量約占菌體總蛋白的60％。該表達(dá)產(chǎn)物為胞液中可溶性蛋白，具有天然VP1蛋白的抗原活性，用其制備成的禽腦脊髓炎VP1亞單位疫苗能有效地保護(hù)禽類免遭禽腦脊髓炎病毒的攻擊。這將為工業(yè)化生產(chǎn)禽腦脊髓炎亞單位滅活疫苗奠定了堅實(shí)的基礎(chǔ)。
文檔編號A61P31/14GK102586166SQ20121004649
公開日2012年7月18日 申請日期2012年3月28日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月28日
發(fā)明者劉新文, 左青山, 胡瀟, 范根成, 郭偉偉 申請人:青島易邦生物工程有限公司