專利名稱：一種豬瘟活疫苗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種豬瘟活疫苗，尤其是一種含有適量滅活草分枝桿菌菌體的豬瘟活疫苗。
背景技術(shù)：
豬痕(Classicalswine fever, CSF)是由豬痕病毒(Classical swine fever virus,CSFV)引起豬的一種高度接觸性、致死性的傳染病。該病唯一的自然宿主是豬，是危害養(yǎng)豬業(yè)最嚴(yán)重的傳染病之一，死亡率能夠達(dá)到90%以上(殷震，劉景華，動(dòng)物病毒學(xué)(第一版)fMl，北京，科學(xué)出版社，1997，652-653)。20世紀(jì)50年代，在各國(guó)研制出較為理想的滅活苗(Dalsgaard K, Overby E. Vaccination of pigs against hog cholera(classical swine fever)with a detergent split vaccine[J]. Acta Vet Scand. 1976,17 :465-474)的同時(shí)，我國(guó)學(xué)者周泰沖等研究的中國(guó)系(C系)豬瘟兔化弱毒疫苗、日本的細(xì)胞弱毒疫苗、和法國(guó)的Thiverval 株等都獲得成功并在豬瘟控制中起了得重要的作用。這三大品系疫苗的廣泛應(yīng)用，改變了全世界豬瘟防制的窘迫局面。目前，國(guó)內(nèi)普遍使用的豬痕活疫苗是1954年培育出豬痕病毒兔化弱毒株(Hog Cholera Lapinized Virus, HCLV)制備而成的。該疫苗具有免疫力快、免疫譜寬、遺傳穩(wěn)定、無(wú)殘毒、不引起胎兒畸變等優(yōu)點(diǎn)。隨著畜牧業(yè)的不斷發(fā)展，對(duì)疫苗品質(zhì)的要求也在不斷提高，高效的豬瘟疫苗更是大勢(shì)所趨。其中，使用免疫增強(qiáng)劑是一種常用的提高疫苗效力的方法。草分枝桿菌是分枝桿菌中的一種，由于分枝桿菌胞壁酰二肽(MDP)具有很強(qiáng)的免疫治療作用，草分枝桿菌多糖MPS在免疫調(diào)節(jié)、抑制病毒復(fù)制方面有很好的效果(周莉婷、 趙晶晶等，分枝桿菌多糖免疫調(diào)節(jié)劑研究進(jìn)展[J]，藥物生物技術(shù)，2011，18 (2) :176-179)， 因而草分枝桿菌是一種優(yōu)秀的免疫增強(qiáng)劑。草分枝桿菌可用于豬瘟活疫苗中，通過(guò)提高宿主自身的免疫應(yīng)答能力來(lái)提增強(qiáng)疫苗免疫力，安全可靠。由于草分枝桿菌發(fā)酵方便、成本低廉，便于臨床大面積推廣使用。草分枝桿菌菌體在添加到豬瘟活疫苗半成品之前需要滅活。由于普通的甲醛滅活劑有殘留的風(fēng)險(xiǎn)，能對(duì)豬瘟病毒產(chǎn)生影響，我們考慮使用β -丙內(nèi)酯對(duì)草分枝桿菌菌體進(jìn)行滅活。由于β-丙內(nèi)酯水溶液半衰期短(10°C時(shí)僅為18hr，25°C時(shí)為3. 5hr，50°C時(shí)為 20min，75°C時(shí)為5min)，能在疫苗液體中完全水解，不必考慮在成品疫苗中的殘留，滅活的草分枝桿菌菌體中無(wú)滅活劑殘留，能夠有效保護(hù)豬瘟病毒的免疫原性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種更加高效的豬瘟活疫苗，從而在將豬瘟活疫苗的免疫水平提高到一個(gè)新的高度，更加有效的預(yù)防免疫豬群豬瘟的發(fā)生。為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明的技術(shù)方案為
將編號(hào)為CGMCC AS 4. 1180的草分枝桿菌菌株，制備成草分枝桿菌菌體；按常規(guī)方法用豬痕病毒(Classical swine fever virus,CSFV)兔化弱毒株(CVCC AV1412)制備成兔源抗原后，按每頭份疫苗中含O. 01 O. lmg，優(yōu)選量為O. 06mg加入草分枝桿菌草分枝桿菌(CGMCC AS 4. 1180菌株)菌體后，再經(jīng)過(guò)混勻、凍干等步驟，制成豬瘟活疫苗(兔源)；按常規(guī)方法用豬瘟病毒兔化弱毒株(CVCC AV1412)制備成細(xì)胞源抗原后，按每頭份疫苗中含O. 01 O. lmg，優(yōu)選量為O. 06mg加入草分枝桿菌菌體后，再經(jīng)過(guò)混勻、凍干等步驟，制成豬瘟活疫苗(細(xì)胞源)。
具體實(shí)施例方式I.草分枝桿菌菌株來(lái)源本發(fā)明涉及到的草分枝桿菌(Mycobacterium phlei)CGMCC AS 4. 1180菌株購(gòu)于北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)中國(guó)科學(xué)院微生物研究所中國(guó)普通微生物保藏管理中心，編號(hào)CGMCC AS 4. 1180(中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)，中國(guó)菌種目錄，機(jī)械工業(yè)出版社，1992，p285)。2.草分枝桿菌菌體的制備(I)種子培養(yǎng)將草分枝桿菌CGMCC AS 4. 1180株置于種子罐中進(jìn)行培養(yǎng)，37°C通氣培養(yǎng)，pH值為7. 0，培養(yǎng)時(shí)間為3 4天，得到發(fā)酵用種子液；種子罐中的培養(yǎng)基配方酵母提取粉I. Og 5. 0g，濃縮麥芽汁(購(gòu)自濟(jì)南雙麥啤酒物資有限公司)2. Og 10. Og,葡萄糖5. Og 50g,磷酸氫二銨I. Og 4. Og,磷酸氫二鉀
O.5g I. Og,注射用水加至IOOOmlo(2)草分枝桿菌發(fā)酵培養(yǎng)將配制好的液體培養(yǎng)基與所培養(yǎng)的種子液一起放入種子罐進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，37°C通氣培養(yǎng)，pH值為7.0，培養(yǎng)時(shí)間為5天；發(fā)酵罐中培養(yǎng)基配方酵母提取粉5. Og 10. 0g，濃縮麥芽汁(購(gòu)自濟(jì)南雙麥啤酒物資有限公司)5. Og 20g,葡萄糖20g IOOg,磷酸氫二銨I. Og 4. Og,磷酸氫二鉀
O.5g I. Og,注射用水加至IOOOmlo⑶后處理將發(fā)酵液用的β -丙內(nèi)酯(V/V終濃度為1/5000 1/3000，優(yōu)選1/4000)滅活， 4°C滅活24h，然后再于37°C水解2h，離心濃縮，棄去上清液，取下層菌體用適量生理鹽水重懸浮3次，離心除去雜質(zhì)，測(cè)定水分，計(jì)算干菌體重量，即得滅活的草分枝桿菌菌體。3.豬瘟活疫苗的制備本發(fā)明的豬瘟活疫苗用的毒種為豬瘟病毒兔化弱毒株，購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，中國(guó)獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心，編號(hào)為CVCC AV1412(中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，中國(guó)獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心，中國(guó)獸醫(yī)菌種目錄，第二版，中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)技術(shù)出版社，2002， pl45)。(I)半成品制備工藝一
I)生產(chǎn)用毒種的制備(兔源脾毒)選擇營(yíng)養(yǎng)良好的家兔，將凍干的豬瘟兔化弱毒株毒種用滅菌生理鹽水制成50倍稀釋的乳劑，每兔耳靜脈注射1ml。選擇定型熱反應(yīng)兔，從體溫下降及其以后的24小時(shí)內(nèi)剖殺。無(wú)菌采取脾臟冷凍或凍干保存，作為生產(chǎn)用毒種。2)制苗用病毒的制備①將生產(chǎn)用毒種用無(wú)菌生理鹽水稀釋50倍后每兔耳靜脈注射1ml。②選定定型熱和輕熱反應(yīng)兔，從體溫下降及其以后的24小時(shí)內(nèi)剖殺，無(wú)菌采取脾臟和淋巴結(jié)，得到高效豬瘟活疫苗半成品，立即配苗或迅速凍結(jié)保存后配苗。工藝二I)生產(chǎn)用毒種的制備(細(xì)胞毒)用細(xì)胞維持液將脾毒制成O. 3% O. 5%的病毒懸液，接種生長(zhǎng)良好的牛睪丸或羊腎單層細(xì)胞，置36 37°C繼續(xù)培養(yǎng)。每隔4 5日收獲換液一次，取二收、三收細(xì)胞培養(yǎng)毒液作為生產(chǎn)用毒種。2)細(xì)胞的制備①無(wú)菌采取牛睪丸，并去除被膜、附睪、腎盂、腎蓋，將組織剪成I 2mm小塊，用 Hank’ s液沖洗至上清液清亮。②將組織塊放入消化瓶中，加入5 8倍的O. 25%胰酶溶液，37°C水浴消化。③棄去胰酶溶液后，脫酶I 3次，再加入營(yíng)養(yǎng)液，以玻璃珠振搖法分散細(xì)胞后，用紗布濾過(guò)，收取細(xì)胞懸液，分裝于培養(yǎng)瓶中，置36 37°C進(jìn)行旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速為10 12r/ h,3 5日長(zhǎng)成單層。④原代細(xì)胞長(zhǎng)成單層后，以(I : 3) (I : 5)制成次代細(xì)胞懸液，繼續(xù)旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)至形成良好單層。3)制苗毒液的制備①取形成良好單層的牛睪丸次代細(xì)胞，棄去培養(yǎng)液，接種含3% 5%生產(chǎn)用細(xì)胞毒種，置36 37 °C繼續(xù)培養(yǎng)。②接毒后5日做第一次收獲換液，以后每隔4日收獲換液I次，得半成品，置于-15°C以下保存。(2)配苗按照每頭份疫苗加入O. 01 O. Img (優(yōu)選O. 06mg)菌體的量，在豬瘟活疫苗半成品中加入草分枝桿菌菌體，并且按照比例加入5%蔗糖脫脂牛奶穩(wěn)定劑或其他凍干保護(hù)劑， 攪拌均勻后分裝，最后進(jìn)行冷凍真空干燥，根據(jù)抗原的不同分別制成豬瘟活疫苗(兔源)和豬瘟活疫苗(細(xì)胞源)。4.對(duì)比試驗(yàn)(I)分別制備不添加草分枝桿菌菌體的豬瘟活疫苗(細(xì)胞源)、豬瘟活疫苗(兔源)和每頭份添加O. 06mg草分枝桿菌菌體的豬瘟活疫苗(細(xì)胞源)、豬瘟活疫苗(兔源)，備用。(2)取四種豬瘟活疫苗，用生理鹽水稀釋成I頭份/ml，分別肌肉注射無(wú)豬瘟中和抗體的豬20頭。
(3)免疫后15日采集免疫豬血清，采用阻斷ELISA方法檢測(cè)豬瘟抗體水平。(4)診斷試劑豬瘟抗體ELISA試劑盒為法國(guó)LSI豬瘟抗體檢測(cè)試劑盒，購(gòu)自北京天之泰生物科技有限公司，生產(chǎn)批號(hào)為5-VETPPC-002。(5)判定標(biāo)準(zhǔn)阻斷率30陰性；< 40而> 30為可疑；> 40為陽(yáng)性。(6)試驗(yàn)結(jié)果
權(quán)利要求
1.一種豬痕活疫苗,其特征是該疫苗含有豬痕病毒(Classical swine fever virus, CSFV)兔化弱毒株(CVCC AV1412)和滅活的草分枝桿菌菌體。
2.一種如權(quán)利要求I所述一種豬瘟活疫苗，其特征在于其中滅活的草分枝桿菌菌體是利用草分枝桿菌(Mycobacterium phlei)CGMCC AS 4. 1180菌株發(fā)酵培養(yǎng)后，使用β-丙內(nèi)酯進(jìn)行滅活的產(chǎn)物。
3.一種制備權(quán)利要求I所述的豬瘟活疫苗的制造方法，其特征在于按常規(guī)方法用豬瘟病毒(Classical swine fever virus)兔化弱毒株(CVCC AV1412)制備成兔源抗原后，按每頭份疫苗中含O. 01 O. lmg，優(yōu)選量為O. 06mg加入滅活的草分枝桿菌菌體，再經(jīng)過(guò)混勻、 凍干等步驟，制成豬瘟活疫苗(兔源)。
4.一種權(quán)利要求I所述的豬瘟活疫苗的制造方法，其特征在于按常規(guī)方法用豬瘟病毒 (Classical swine fever virus)兔化弱毒株(CVCC AV1412)制備成細(xì)胞源抗原后,按每頭份疫苗中含O. 01 O. lmg，優(yōu)選量為O. 06mg加入滅活的草分枝桿菌菌體后，再經(jīng)過(guò)凍干等步驟，制成豬瘟活疫苗(細(xì)胞源)。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種豬瘟活疫苗及其生產(chǎn)方法。該疫苗是在普通商品化豬瘟活疫苗中加入了適量的草分枝桿菌菌體，注射后通過(guò)提高宿主自身的免疫應(yīng)答能力，并與豬瘟病毒兔化弱毒株抗原協(xié)同作用，達(dá)到增強(qiáng)疫苗免疫力的作用，安全可靠。由于草分枝桿菌發(fā)酵方便、成本低廉，可應(yīng)用于高效豬瘟活疫苗的生產(chǎn)中。本發(fā)明提高了豬瘟活疫苗的免疫效果，能夠更加有效的預(yù)防豬瘟的發(fā)生，具有直接的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益。
文檔編號(hào)A61P31/14GK102600469SQ20121005730
公開日2012年7月25日 申請(qǐng)日期2012年3月7日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月7日
發(fā)明者劉紅娟, 吳昊, 徐龍濤, 王蕾, 鮑海忠 申請(qǐng)人:齊魯動(dòng)物保健品有限公司