專利名稱：四價腦膜炎球菌多糖疫苗的制備工藝的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及疫苗制備領(lǐng)域，具體的，涉及四價腦膜炎球菌多糖疫苗的制備工藝。
背景技術(shù)：
流行性腦脊髓膜炎是由腦膜炎雙球菌引起的化膿性腦膜炎，簡稱流腦。流腦的流行早在16世紀(jì)即被發(fā)現(xiàn)，易感人群主要為兒童及青少年。發(fā)病癥狀分普通型和爆發(fā)型；普通型表現(xiàn)為劇烈頭疼、頻繁嘔吐、煩躁不安和頸項強直凱爾尼格征和布魯津斯基征陽性等腦膜刺激癥狀，伴有呼吸、循環(huán)衰竭或其它并發(fā)癥；爆發(fā)型多見于兒童病人。起病急劇，病情兇險，如不及時搶救，常在M小時內(nèi)危及生命。爆發(fā)型病死率最高可達(dá)40~60%。任何年齡都可發(fā)病，其中14歲以下年齡、尤其是7歲以下兒童發(fā)病率最高。腦膜炎雙球菌隱藏于患者或帶菌者的鼻咽分泌物中，主要通過咳嗽、打噴嚏、說話等由飛沫直接從空氣傳播，進入呼吸道而引起感染。從全球來看，流腦散發(fā)病例和地方性流行仍然在危害人類健康。其流行的地域分布極廣，幾乎遍及各大洲。各國之間流腦的發(fā)病水平差異很大，在發(fā)展中國家發(fā)病率相對較高，在非洲發(fā)病率最高。當(dāng)今，全世界每年發(fā)生30萬 35萬流腦病例。高發(fā)地區(qū)依然是非洲、亞洲和南美洲。非洲撒哈拉以南的“腦膜炎地帶“的發(fā)病率最高，在流行年度可高達(dá) 400 /十萬 800 /十萬。由于地理及氣候原因，流行季節(jié)一般在11月底至次年6月底之間。這一地帶向東已延伸至埃塞俄比亞，往西已擴大到塞內(nèi)加爾，涉及18個國家，約有3億人口，且還有擴大的趨勢。自1980年起，這一地帶呈有規(guī)律地暴發(fā)流行。近年來，流行性腦脊髓膜炎爆發(fā)流行由過去的A群為主，逐漸演變?yōu)锳群與其他群并存。1996年，南撒哈拉非洲國家發(fā)生一次歷史上最大的流腦流行，報道病例數(shù)達(dá)18萬以上，死亡18000人，流行菌群以B群和C群為主。2000年與2001年沙特阿拉伯哈吉地區(qū)兩次爆發(fā)流行性腦脊髓膜炎， 共發(fā)病500多例，其中230多例為W135群，其余均為A群。據(jù)WHO報告，2002年春季布基納法索爆發(fā)流腦，發(fā)病12，587例，死亡1，447例，死亡率11.5%。也主要以W135群為主。 我國在1938年、1949年、1959年、1967年、1977年共發(fā)生過五次全國性流腦大流行，平均約 8 10年流行一次，主要以A群腦膜炎雙球菌引起的流腦流行為主。1967年春季發(fā)病率達(dá)到最高峰，為403/10萬，病死率5. 49%。80年代初我國研制的A群流腦多糖疫苗獲準(zhǔn)投入使用，預(yù)防效果良好，80年代以后我國未再發(fā)生全國性的大流行。1985年發(fā)病率為9. 9/10 萬，1986年 1989年的發(fā)病率依次為7. 56/10萬、3. 21/10萬、1. 97/10萬、1. 32/10萬。疫苗的使用，有效地控制了流行高峰。但散發(fā)病例仍然存在。根據(jù)流行規(guī)律，推測近幾年我國將是流行性腦脊髓膜炎的流行周期。近年來，流行性腦脊髓膜炎的流行還具有菌群漂移的特點，如美國從前為A群流行性腦脊髓膜炎流行，以后為B群流行性腦脊髓膜炎流行，再后來又轉(zhuǎn)為C群流行性腦脊髓膜炎流行，目前則轉(zhuǎn)為Y群流行。我國的流行性腦脊髓膜炎流行主要以A群為主。隨著A群流腦多糖疫苗的廣泛使用，人群對A群流腦雙球菌具有一定的免疫力，由A群流腦雙球菌引起的流行性腦脊髓膜炎比例呈逐年下降趨勢，而由C群及其他群流腦雙球菌引起的流行性腦脊髓膜炎病例逐年上升。最近幾年C群流行性腦脊髓膜炎局部爆發(fā)偶有發(fā)生，去年12月至今年1月安徽省11市共發(fā)生C群流行性腦脊髓膜炎病例 60例，死亡8例。福建省去年底也發(fā)生4例C群流行性腦脊髓膜炎。從流行趨勢看，C群流行性腦脊髓膜炎發(fā)病例數(shù)逐年增多，發(fā)病范圍逐漸擴大。此外，也不排除非洲國家流行的 W135群流行性腦脊髓膜炎，美國流行的Y群等流行性腦脊髓膜炎輸入我國的可能性。在非洲和亞洲都存在流行性腦脊髓膜炎流行帶，過去也都以A群流行性腦脊髓膜炎流行為主， 但非洲流行性腦脊髓膜炎流行帶已轉(zhuǎn)為W135群流行為主，A群流行為輔的現(xiàn)象。隨著國際間交流的增加，人員流動頻繁，在國外流行的Y型和W135型流腦輸入我國的可能性也在增加。因此，研制(A+C+Y+W135)四價腦膜炎球菌多糖疫苗具有重要意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供四價腦膜炎球菌多糖疫苗的制備工藝，該制備工藝可以制備得到的四價腦膜炎球菌多糖疫苗，為四價疫苗，注射一針即有多種免疫效用； 并且該疫苗安全性和各項檢定參數(shù)都符合標(biāo)準(zhǔn)。本發(fā)明解決上述技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是四價腦膜炎球菌多糖疫苗的制備工藝，其特征在于，包括如下步驟
(1)選用菌種生產(chǎn)用菌種為A群腦膜炎奈瑟氏球菌菌種、C群腦膜炎奈瑟氏球菌菌種、 Y群腦膜炎奈瑟氏球菌菌種和W135群腦膜炎奈瑟氏球菌菌種；
(2)種子批的建立及傳代將1支原始種子凍干菌種開啟后，接種在10%羊血瓊脂培養(yǎng)基上，放于35 37°C、5 10% 二氧化碳環(huán)境培養(yǎng)16 20小時傳第二代，將第二代培養(yǎng)物采入無菌脫脂牛奶中，混勻凍干制備主代種子批；再將1支主種子批菌種開啟后，接種在 10%羊血瓊脂培養(yǎng)基上，放于35 37°C、5 10% 二氧化碳環(huán)境培養(yǎng)16 20小時傳第二代，凍干為工作種子批；所述主種子批和所述工作種子批菌種凍干后進行生物學(xué)特性檢定， 所述主種子批和所述工作種子批菌種的生物學(xué)特性與原始種子批菌種一致；
(3)生產(chǎn)疫苗原液開啟工作種子批菌種1支，接種于10%羊血瓊脂培養(yǎng)基制備第一代， 將第1代菌種接種于改良半綜合固體培養(yǎng)基，繼續(xù)傳代第2代，將第2代菌種接種于改良半綜合固體培養(yǎng)基，繼續(xù)傳代第3代，將第3代菌種接種于改良半綜合液體培養(yǎng)基，繼續(xù)傳代第4代，繼續(xù)將第4代菌種接種至大罐培養(yǎng)，大罐培養(yǎng)為第5代，第5代的大罐培養(yǎng)為改良半綜合液體培養(yǎng)基；第5代大罐培養(yǎng)的培養(yǎng)物生產(chǎn)疫苗原液，每1支工作種子用于1批疫苗原液生產(chǎn)；所述第5代大罐培養(yǎng)采用培養(yǎng)罐液體培養(yǎng)；
(4)收獲及殺菌于對數(shù)生長期的后期或靜止期的前期收獲終止培養(yǎng)，終止培養(yǎng)時取樣進行純菌試驗，合格后在收獲的培養(yǎng)液中加入甲醛溶液至終濃度按體積分?jǐn)?shù)計為1%，殺菌 30分鐘；
(5)去菌體將已殺菌的培養(yǎng)液經(jīng)HOOOrpm管式連續(xù)流離心機離心，離心流速為 1500 1600ml/min,收集上清液；
(6)沉淀、解離所述步驟(5)收集的上清液，加入10%十六烷基三甲基溴化銨至終濃度按體積分?jǐn)?shù)計為0. 1%，充分混勻，A群靜置3 5小時，Y群靜置5 8小時，C、W135群靜置8 12小時；以14000rpm管式連續(xù)流離心機離心，離心流速為2000 2500ml/min,離心后收集沉淀物；將收集的沉淀物用lmol/LCaCl2研磨均勻，得到混勻的多糖復(fù)合物；將所述混勻的多糖復(fù)合物收集于瓶中，放在磁力攪拌器上，攪拌1小時，使多糖與十六烷基三甲基溴化銨充分解離；
(7)去核酸在多糖復(fù)合物中加入2 8°C冷卻過的95%的乙醇至終濃度按體積分?jǐn)?shù)計為25%，搖勻，2 8°C存放，A群多糖靜置存放1 3小時，C群和W135群靜置存放16 20小時，Y群多糖靜置存放10 14小時；4000rpm離心30分鐘，去沉淀，收集上清液；
(8)沉淀收集多糖于上述上清液中加入2 8°C冷卻過95%乙醇至最終濃度為A群按體積分?jǐn)?shù)計為80% ；C群、Y群及W135群按體積分?jǐn)?shù)計為75%，充分振搖，待沉淀出現(xiàn)后靜置1 2小時；4000rpm離心5分鐘收集沉淀；用無水乙醇和丙酮洗滌2次以上，收集多糖沉淀，壓縮空氣風(fēng)干；干燥沉淀物即為多糖粗制品；保存在-20°C或以下，待純化；
(9)超濾膜過程去除雜蛋白和內(nèi)毒素將所述步驟(8)得到的多糖粗制品溶解于1/ 10飽和中性乙酸鈉溶液中，A群使其濃度達(dá)15 20mg / ml，C群、Y群和W135群使其濃度達(dá)10 15mg / ml ；用截留分子量為6000道爾頓的超濾膜進行超濾，使雜蛋白和內(nèi)毒素被截留在超濾膜上從而被去除掉，收集超濾液為收獲液；
(10)沉淀精多糖將步驟(10)收集的收獲液中加入95%的乙醇至終濃度為A群按體積分?jǐn)?shù)計為80%，C群、Y群及W135群按體積分?jǐn)?shù)計為75% ；充分搖勻，置冷庫2 8°C 1小時， 4000rpm 10分鐘離心收集沉淀物；用無水乙醇和丙酮洗滌2次以上，收集多糖沉淀，壓縮空氣風(fēng)干，干燥沉淀物即為精多糖，保存在-20°C或以下；提取過程在15°C以下進行。用無菌注射用水溶解精多糖，經(jīng)除菌過濾后即為原液，要求過濾前后0. 2Mm濾膜完整性試驗合格， 原液取樣后進行檢定；
(11)半成品配制合并單批或兩批以上的原液后即為半成品，用無菌無熱原乳糖和滅菌注射用水稀釋至含A群、C群、Y群、W135群多糖分別為100.0yg/ml，乳糖為20mg/ml ；稀釋后立即經(jīng)0. 2μπι過濾，過濾抽樣送檢，于2 8°C保存；
(12)分裝、凍干，制備疫苗成品上述半成品采用洗烘灌聯(lián)動機組分裝，玻璃管制注射劑瓶盛裝，分裝規(guī)格為0. 5ml/瓶，分裝過程中自動加鹵化丁基橡膠塞，分裝完成后，在分裝后6小時內(nèi)凍干；凍干完成即進行真空壓塞和軋蓋；完成軋蓋的制品進行透視檢查及貼簽；完成貼簽的制品即凍干疫苗成品，送2 8°C冷庫保存。進一步的，所述步驟(4)菌體培養(yǎng)達(dá)到對數(shù)生長期的后期或靜止期的前期的判斷方法為，細(xì)菌濃度不再增加，達(dá)到160億/ml或pH開始回升至7. 0 7. 5。進一步的，所述步驟(3)大罐培養(yǎng)的培養(yǎng)條件培養(yǎng)基量為300 600L，通氣量為 10 30m3/h，攪拌速度為200 ;350rpm,用20%Na0H溶液維持pH在6. 70 7. 40 ；在培養(yǎng)過程中，進行菌液濃度測定和革蘭氏染色鏡檢，如發(fā)現(xiàn)污染雜菌，121°C，30min滅菌處理后廢棄。進一步的，所述10%羊血瓊脂培養(yǎng)基的配方為以IOOml計，含有羊血IOml ；瓊脂培養(yǎng)基100 ml。進一步的，所述改良半綜合固體培養(yǎng)基的配方為以IOOOml計，含有
50%鹽酸酪素水解液或鹽酸水解酪蛋白按總氮計算為1300mg ；洲鹽酸酪素水解液按總氮計算為1300mg ；酵母透析液50ml ；淀粉5g ；磷酸二氫鉀Ig ；硫酸鎂0. 6g ；葡萄糖2g ；瓊脂 26go進一步的，所述改良半綜合液體培養(yǎng)基由甲液和乙液構(gòu)成，以10000ml計的配方為所述甲液包括 50%鹽酸酪素水解液或鹽酸水解酪蛋白按總氮計算為13000mg ；酵母透析液IOOml ；氯化鉀IOg ；L-谷氨酸鈉IOg ；氯化銨12. 5g ；十二水合磷酸氫二鈉7. 5g ；磷酸二氫鈉2. 5g ； 10%胱氨酸溶液3ml ；所述乙液包括硫酸鎂6g和葡萄糖55g。綜上所述，本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，其優(yōu)點在于本發(fā)明采用了超濾膜過程實現(xiàn)了一步法同時去除去除雜蛋白和內(nèi)毒素的目的；不僅確保了本發(fā)明制備得到的ACYW135四價腦膜炎球菌多糖疫苗的純度和免疫活性符合標(biāo)準(zhǔn)，減少了制備工藝的經(jīng)濟成本。
具體實施例方式下面結(jié)合實施例，對本發(fā)明作進一步的詳細(xì)說明，但本發(fā)明的實施方式不限于此。實施例1 ACYW135四價腦膜炎球菌多糖疫苗的制備四價腦膜炎球菌多糖疫苗的制備工藝，包括如下步驟
(1)選用菌種生產(chǎn)用菌種為A群腦膜炎奈瑟氏球菌菌種、C群腦膜炎奈瑟氏球菌菌種、 Y群腦膜炎奈瑟氏球菌菌種和W135群腦膜炎奈瑟氏球菌菌種；
(2)種子批的建立及傳代生產(chǎn)用菌種應(yīng)建立種子批系統(tǒng)。原始種子批應(yīng)驗明其記錄、 歷史、來源和生物學(xué)特性。將1支原始種子凍干菌種開啟后，接種在10%羊血瓊脂培養(yǎng)基上， 放于35 37°C、5 10% 二氧化碳環(huán)境培養(yǎng)16 20小時，在35 37°C條件下傳第二代， 將第二代培養(yǎng)物采入無菌脫脂牛奶中混勻凍干制備主代種子批。再將1支主種子批菌種開啟后，采用上述相同條件培養(yǎng)傳至第二代，擴增后凍干為工作種子批。主種子批和工作種子批菌種凍干后均必須進行生物學(xué)特性檢定，主種子批和工作種子批菌種的各種生物學(xué)特性應(yīng)與原始種子批菌種一致。主種子批菌種用于生產(chǎn)工作種子批，工作種子批用于生產(chǎn)疫苗。 主種子批由原始種子批開啟后傳2代制備，主種子批開啟后傳2代制備工作種子批；工作種子批開啟后傳4代制備生產(chǎn)用種子。工作種子批開啟后至接種發(fā)酵罐培養(yǎng)傳代次數(shù)不得超過5代。(3)生產(chǎn)疫苗原液開啟工作種子批菌種1支，接種于10%羊血瓊脂培養(yǎng)基2支， 放35 37°C、5 10% 二氧化碳環(huán)境培養(yǎng)16 20小時，涂片鏡檢合格，將第1代菌種接種于改良半綜合固體培養(yǎng)基4 6瓶，繼續(xù)傳代第2代，于35 37°C、5 10% 二氧化碳環(huán)境培養(yǎng)10 18小時，涂片鏡檢合格后將第2代菌種接種于改良半綜合固體培養(yǎng)基20 25 瓶，繼續(xù)傳代第3代，于35 37°C培養(yǎng)10 18小時，涂片鏡檢合格后將第3代菌種接種于改良半綜合液體培養(yǎng)基30 40 L，繼續(xù)傳代第4代，繼續(xù)將第4代，于35 37°C深層通氣攪拌培養(yǎng)3 8小時，涂片鏡檢及細(xì)菌濃度測定合格后將將第4代菌種作為生產(chǎn)用種子接種至大罐培養(yǎng)。所述大罐培養(yǎng)的培養(yǎng)條件為采用培養(yǎng)罐液體培養(yǎng)，培養(yǎng)基為改良半綜合液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)基量為300 600L。于大罐培養(yǎng)基中接種第4代生產(chǎn)用種子后，深層通氣攪拌培養(yǎng)。通氣量為10 30m3/h，攪拌速度為200 350rpm。用20%Na0H溶液維持pH 在6. 70 7. 40范圍。在培養(yǎng)過程中，進行菌液濃度測定和革蘭氏染色鏡檢，如發(fā)現(xiàn)污染雜菌，應(yīng)121°C 30min滅菌處理后廢棄。大罐培養(yǎng)的培養(yǎng)物生產(chǎn)疫苗原液，每1支工作種子用于1批疫苗原液生產(chǎn)。(4)收獲及殺菌于對數(shù)生長期的后期或靜止期的前期收獲終止培養(yǎng)，終止培養(yǎng)時取樣進行純菌試驗，合格后在收獲的培養(yǎng)液中加入甲醛溶液至終濃度按體積分?jǐn)?shù)計為1%， 殺菌30分鐘；于對數(shù)生長期的后期或靜止期的前期收獲終止培養(yǎng)，A群、C群及W135群培養(yǎng)一般為6.5 士 1小時，Y群培養(yǎng)一般為11 士 3小時，當(dāng)細(xì)菌濃度不再增加，達(dá)到160億/ml或PH開始回升至7. 0 7. 5時即可終止培養(yǎng)，終止培養(yǎng)時取樣進行純菌試驗，在收獲的培養(yǎng)液中加入甲醛溶液至終濃度1% (V/V)，殺菌30分鐘。(5)去菌體將已殺菌的培養(yǎng)液經(jīng)HOOOrpm管式連續(xù)流離心機離心，離心流速為 1500 1600ml/min,收集上清液。(6)沉淀、解離所述步驟(5)收集的上清液，加入10%十六烷基三甲基溴化銨至終濃度按體積分?jǐn)?shù)計為0. 1%，充分混勻，A群靜置3 5小時，Y群靜置5 8小時，C、W135 群靜置8 12小時；以HOOOrpm管式連續(xù)流離心機離心，離心流速為2000 2500ml/min， 離心后收集沉淀物；將收集的沉淀物用lmol/LCaCl2研磨均勻，得到混勻的多糖復(fù)合物；將所述混勻的多糖復(fù)合物收集于瓶中，放在磁力攪拌器上，攪拌1小時，使多糖與十六烷基三甲基溴化銨充分解離。(7)去核酸在多糖復(fù)合物中加入2 8°C冷卻過的95%的乙醇至終濃度按體積分?jǐn)?shù)計為25%，搖勻，2 8°C存放，A群多糖靜置存放1 3小時，C群和W135群靜置存放 16 20小時，Y群多糖靜置存放10 14小時；4000rpm離心30分鐘，去沉淀，收集上清液；
(8)沉淀收集多糖于上述上清液中加入2 8°C冷卻過95%乙醇至最終濃度為A群按體積分?jǐn)?shù)計為80% ；C群、Y群及W135群按體積分?jǐn)?shù)計為75%，充分振搖，待沉淀出現(xiàn)后靜置1 2小時；4000rpm離心5分鐘收集沉淀；用無水乙醇和丙酮洗滌2次以上，收集多糖沉淀，壓縮空氣風(fēng)干；干燥沉淀物即為多糖粗制品；保存在-20°C或以下，待純化。(9)超濾膜過程去除雜蛋白和內(nèi)毒素將所述步驟(8)得到的多糖粗制品溶解于 1 / 10飽和中性乙酸鈉溶液中，A群使其濃度達(dá)15 20mg / ml，C群、Y群和W135群使其濃度達(dá)10 15mg / ml ；用截留分子量為6000道爾頓的超濾膜進行超濾，使雜蛋白和內(nèi)毒素被截留在超濾膜上從而被去除掉，收集超濾液為收獲液。所述超濾運行壓力為200kPa，超濾膜過程實現(xiàn)了一步法去除雜蛋白和內(nèi)毒素的效果，因此工藝步驟較少，并且減少了對抗原的破壞。經(jīng)超濾膜過程處理后A、C群多糖中雜蛋白含量分別< 10mg/g，Y群多糖中雜蛋白含量<35.6mg/g，W135群多糖中雜蛋白含量 < 35. 2mg/g, A、C、Y及W135群多糖內(nèi)毒素含量分別< 12 EU/μ g，抗原回收率A群多糖 > 65. 2%, C群多糖> 75. 5%, Y及Wl!35群多糖分別> 80%。(10)沉淀精多糖將步驟(10)收集的收獲液中加入95%的乙醇至終濃度為A群按體積分?jǐn)?shù)計為80%，C群、Y群及W135群按體積分?jǐn)?shù)計為75%;充分搖勻，置冷庫2 8°C 1 小時，4000rpm，10分鐘離心收集沉淀物；用無水乙醇和丙酮洗滌2次以上，收集多糖沉淀， 壓縮空氣風(fēng)干，干燥沉淀物即為精多糖，保存在-20°C或以下；提取過程在15°C以下進行。 用無菌注射用水溶解精多糖，經(jīng)除菌過濾后即為原液，要求過濾前后0. 2Mm濾膜完整性試驗合格，原液取樣后進行檢定；
(11)半成品配制合并單批或兩批以上的原液后即為半成品，用無菌無熱原乳糖和滅菌注射用水稀釋至含A群、C群、Y群、W135群多糖分別為100.0yg/ml，乳糖為20mg/ml ；稀釋后立即經(jīng)0. 2μπι過濾，過濾抽樣送檢，于2 8°C保存；
(12)分裝、凍干，制備疫苗成品上述半成品采用洗烘灌聯(lián)動機組分裝，玻璃管制注射劑瓶盛裝，分裝規(guī)格為0. 5ml/瓶，分裝過程中自動加鹵化丁基橡膠塞，分裝完成后，在分裝后6小時內(nèi)凍干；凍干完成即進行真空壓塞和軋蓋；完成軋蓋的制品進行透視檢查及貼簽；完成貼簽的制品即凍干疫苗成品，送2 8°C冷庫保存。所述透視檢查采用目測法逐瓶透檢，剔除脫蓋、裝量、空瓶、破瓶、異物、萎縮等外觀不合格產(chǎn)品。透視檢查環(huán)境溫度不得高于 30°C，檢查完成及時進行貼簽。采用貼標(biāo)機進行貼簽，每瓶疫苗貼上(ACYW13Q四價腦膜炎球菌多糖疫苗標(biāo)簽1張，完成貼簽的制品及時送2 8°C冷庫保存待包裝。整個透視檢查及貼簽過程環(huán)境溫度不得高于30°C。本發(fā)明疫苗制備工藝的原液生產(chǎn)收率開啟1支工作種子按每100L大罐培養(yǎng)量計可制造出粗制多糖A群16 51g、(群9 四8、￥群2 6g、W1!35群3 9g。本發(fā)明疫苗制備工藝每批精多糖的收率=(收得精多糖量)/ (精制前投入的粗多糖量)X 100%，從粗多糖至精多糖的提取純化過程的收率各群分別為A群35 59%、C群 41 57%、Y 群 35 79%、W135 群 29 77%。實施例2 生產(chǎn)用培養(yǎng)基
上述制備工藝過程使用的培養(yǎng)基如下
生產(chǎn)用種子的制備第1代為10%羊血瓊脂培養(yǎng)基，第2代至第3代為改良半綜合固體培養(yǎng)基，第4代的生產(chǎn)用種子菌種制備以及第5代的大罐培養(yǎng)為改良半綜合液體培養(yǎng)基。生產(chǎn)用的改良半綜合液體培養(yǎng)基不含有能與加入的十六烷基三甲基溴化銨形成沉淀的成分， 不含有對人體有害或其他過敏原物質(zhì)。a 10%羊血瓊脂培養(yǎng)基
物料名稱配方(以IOOml為例計)羊血IOml瓊脂培養(yǎng)基IOOml
b改良半綜合固體培養(yǎng)基的配方(以IOOOml為例計)見下表
物料名稱配方(以IOOOml為例計)50%鹽酸酪素水解液或鹽酸水解酪蛋白I3OOmg(按總氮計算)2%鹽酸酪素水解液I3OOmg(按總氮計算)酵母透析液50ml淀粉5g磷酸二氫鉀Ig硫酸鎂0.6g葡萄糖2g瓊脂26g
c流腦半綜合液體培養(yǎng)基的配方(以10000ml為例計)見下表
權(quán)利要求
1.四價腦膜炎球菌多糖疫苗的制備工藝，其特征在于，包括如下步驟(1)選用菌種生產(chǎn)用菌種為A群腦膜炎奈瑟氏球菌菌種、C群腦膜炎奈瑟氏球菌菌種、 Y群腦膜炎奈瑟氏球菌菌種和W135群腦膜炎奈瑟氏球菌菌種；(2)種子批的建立及傳代將1支原始種子凍干菌種開啟后，接種在10%羊血瓊脂培養(yǎng)基上，放于35 37°C、5 10% 二氧化碳環(huán)境培養(yǎng)16 20小時傳第二代，將第二代培養(yǎng)物采入無菌脫脂牛奶中，混勻凍干制備主代種子批；再將1支主種子批菌種開啟后，接種在 10%羊血瓊脂培養(yǎng)基上，放于35 37°C、5 10% 二氧化碳環(huán)境培養(yǎng)16 20小時傳第二代，凍干為工作種子批；所述主種子批和所述工作種子批菌種凍干后進行生物學(xué)特性檢定， 所述主種子批和所述工作種子批菌種的生物學(xué)特性與原始種子批菌種一致；(3)生產(chǎn)疫苗原液開啟工作種子批菌種1支，接種于10%羊血瓊脂培養(yǎng)基制備第一代， 將第1代菌種接種于改良半綜合固體培養(yǎng)基，繼續(xù)傳代第2代，將第2代菌種接種于改良半綜合固體培養(yǎng)基，繼續(xù)傳代第3代，將第3代菌種接種于改良半綜合液體培養(yǎng)基，繼續(xù)傳代第4代，繼續(xù)將第4代菌種接種至大罐培養(yǎng)，大罐培養(yǎng)為第5代，第5代的大罐培養(yǎng)為改良半綜合液體培養(yǎng)基；第5代大罐培養(yǎng)的培養(yǎng)物生產(chǎn)疫苗原液，每1支工作種子用于1批疫苗原液生產(chǎn)；所述第5代大罐培養(yǎng)采用培養(yǎng)罐液體培養(yǎng)；(4)收獲及殺菌于對數(shù)生長期的后期或靜止期的前期收獲終止培養(yǎng)，終止培養(yǎng)時取樣進行純菌試驗，合格后在收獲的培養(yǎng)液中加入甲醛溶液至終濃度按體積分?jǐn)?shù)計為1%，殺菌 30分鐘；(5)去菌體將已殺菌的培養(yǎng)液經(jīng)HOOOrpm管式連續(xù)流離心機離心，離心流速為 1500 1600ml/min,收集上清液；(6)沉淀、解離所述步驟(5)收集的上清液，加入10%十六烷基三甲基溴化銨至終濃度按體積分?jǐn)?shù)計為0. 1%，充分混勻，A群靜置3 5小時，Y群靜置5 8小時，C、W135群靜置8 12小時；以14000rpm管式連續(xù)流離心機離心，離心流速為2000 2500ml/min,離心后收集沉淀物；將收集的沉淀物用lmol/LCaCl2研磨均勻，得到混勻的多糖復(fù)合物；將所述混勻的多糖復(fù)合物收集于瓶中，放在磁力攪拌器上，攪拌1小時，使多糖與十六烷基三甲基溴化銨充分解離；(7)去核酸在多糖復(fù)合物中加入2 8°C冷卻過的95%的乙醇至終濃度按體積分?jǐn)?shù)計為25%，搖勻，2 8°C存放，A群多糖靜置存放1 3小時，C群和W135群靜置存放16 20小時，Y群多糖靜置存放10 14小時；4000rpm離心30分鐘，去沉淀，收集上清液；(8)沉淀收集多糖于上述上清液中加入2 8°C冷卻過95%乙醇至最終濃度為A群按體積分?jǐn)?shù)計為80% ；C群、Y群及W135群按體積分?jǐn)?shù)計為75%，充分振搖，待沉淀出現(xiàn)后靜置1 2小時；4000rpm離心5分鐘收集沉淀；用無水乙醇和丙酮洗滌2次以上，收集多糖沉淀，壓縮空氣風(fēng)干；干燥沉淀物即為多糖粗制品；保存在-20°C或以下，待純化；(9)超濾膜過程去除雜蛋白和內(nèi)毒素將所述步驟(8)得到的多糖粗制品溶解于1/ 10飽和中性乙酸鈉溶液中，A群使其濃度達(dá)15 20mg / ml，C群、Y群和W135群使其濃度達(dá)10 15mg / ml ；用截留分子量為6000道爾頓的超濾膜進行超濾，使雜蛋白和內(nèi)毒素被截留在超濾膜上從而被去除掉，收集超濾液為收獲液；(10)沉淀精多糖將步驟(10)收集的收獲液中加入95%的乙醇至終濃度為A群按體積分?jǐn)?shù)計為80%，C群、Y群及W135群按體積分?jǐn)?shù)計為75% ；充分搖勻，置冷庫2 8°C 1小時，4000rpm 10分鐘離心收集沉淀物；用無水乙醇和丙酮洗滌2次以上，收集多糖沉淀，壓縮空氣風(fēng)干，干燥沉淀物即為精多糖，保存在-20°C或以下；提取過程在15°C以下進行；用無菌注射用水溶解精多糖，經(jīng)除菌過濾后即為原液，要求過濾前后0. 2Mm濾膜完整性試驗合格， 原液取樣后進行檢定；(11)半成品配制合并單批或兩批以上的原液后即為半成品，用無菌無熱原乳糖和滅菌注射用水稀釋至含A群、C群、Y群、W135群多糖分別為100.0yg/ml，乳糖為20mg/ml ；稀釋后立即經(jīng)0. 2μπι過濾，過濾抽樣送檢，于2 8°C保存；(12)分裝、凍干，制備疫苗成品上述半成品采用洗烘灌聯(lián)動機組分裝，玻璃管制注射劑瓶盛裝，分裝規(guī)格為0. 5ml/瓶，分裝過程中自動加鹵化丁基橡膠塞，分裝完成后，在分裝后6小時內(nèi)凍干；凍干完成即進行真空壓塞和軋蓋；完成軋蓋的制品進行透視檢查及貼簽；完成貼簽的制品即凍干疫苗成品，送2 8°C冷庫保存。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的四價腦膜炎球菌多糖疫苗的制備工藝，其特征在于，所述步驟(4)菌體培養(yǎng)達(dá)到對數(shù)生長期的后期或靜止期的前期的判斷方法為，細(xì)菌濃度不再增加， 達(dá)到160億/ml或pH開始回升至7. 0 7. 5。
3.根據(jù)權(quán)利要求2任一項所述的四價腦膜炎球菌多糖疫苗的制備工藝，其特征在于， 所述步驟(3)大罐培養(yǎng)的培養(yǎng)條件培養(yǎng)基量為300 600L，通氣量為10 30m3/h，攪拌速度為200 350rpm，用20%Na0H溶液維持pH在6. 70 7. 40 ；在培養(yǎng)過程中，進行菌液濃度測定和革蘭氏染色鏡檢，如發(fā)現(xiàn)污染雜菌，121°C，30min滅菌處理后廢棄。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的四價腦膜炎球菌多糖疫苗的制備工藝，其特征在于，所述10% 羊血瓊脂培養(yǎng)基的配方為以IOOml計，含有羊血IOml ；瓊脂培養(yǎng)基100 ml。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4任一項所述的四價腦膜炎球菌多糖疫苗的制備工藝，其特征在于，所述改良半綜合固體培養(yǎng)基的配方為以IOOOml計，含有50%鹽酸酪素水解液或鹽酸水解酪蛋白按總氮計算為1300mg ；洲鹽酸酪素水解液按總氮計算為1300mg ；酵母透析液50ml ；淀粉5g ；磷酸二氫鉀Ig ；硫酸鎂0. 6g ；葡萄糖2g ；瓊脂26g。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5任一項所述的四價腦膜炎球菌多糖疫苗的制備工藝，其特征在于，所述改良半綜合液體培養(yǎng)基由甲液和乙液構(gòu)成，以10000ml計的配方為所述甲液包括50%鹽酸酪素水解液或鹽酸水解酪蛋白按總氮計算為13000mg ； 酵母透析液IOOml ； 氯化鉀IOg ；L-谷氨酸鈉IOg; 氯化銨12. 5g ；十二水合磷酸氫二鈉7. 5g ； 磷酸二氫鈉2. 5g ； 10%胱氨酸溶液3ml ； 所述乙液包括硫酸鎂6g和葡萄糖55g。
全文摘要
本發(fā)明公開四價腦膜炎球菌多糖疫苗的制備工藝，包括如下步驟選用菌種；種子批的建立及傳代；生產(chǎn)疫苗原液；收獲及殺菌;去菌體；沉淀、解離；去核酸；沉淀收集多糖；超濾膜過程去除雜蛋白和內(nèi)毒素；沉淀精多糖；半成品配制；分裝、凍干，制備疫苗成品。該制備工藝可以制備得到的四價腦膜炎球菌多糖疫苗為四價疫苗，注射一針即有多種免疫效用；并且該疫苗安全性和各項檢定參數(shù)都符合標(biāo)準(zhǔn)。
文檔編號A61P31/04GK102327605SQ201110245718
公開日2012年1月25日 申請日期2011年8月25日 優(yōu)先權(quán)日2011年8月25日
發(fā)明者侯文禮, 廖常如, 張濤, 鐘澤榮 申請人:成都康華生物制品有限公司