專利名稱：針對乙肝病毒基因的siRNA序列及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)，涉及基因工程技術(shù)領(lǐng)域和生物信息學(xué)領(lǐng)域，具體地涉及針對乙肝病毒(HBV)基因的siRNA靶序列的設(shè)計、合成及其在體內(nèi)外抑制HBV的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
RNA干擾(RNA interference，RNAi)現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)，被《SCIENCE》雜志和美國科學(xué)促進(jìn)會評為2002年十大科學(xué)成就之一。RNA干擾是指同源雙鏈RNA的導(dǎo)入引起目標(biāo)基因的不表達(dá)或減效表達(dá)，在哺乳動物細(xì)胞中，21-23個核苷酸長度的雙鏈RNA(double-stranded RNA，dsRNA)，可有效降解同源RNA，從而阻斷蛋白質(zhì)的表達(dá)，這些特定長度的dsRNA被稱為siRNA(small interferingRNAs)。RNA干擾被稱為RNA基礎(chǔ)上的細(xì)胞“免疫”系統(tǒng)。
經(jīng)證實RNA干擾技術(shù)具有以下特點(diǎn)(1)特異性高一個堿基的不同就可導(dǎo)致作用的顯著降低；(2)高效少量siRNA分子就能較徹底抑制細(xì)胞內(nèi)相應(yīng)基因的表達(dá)；(3)穩(wěn)定由于RNA干擾采用的是雙鏈RNA，它比較穩(wěn)定，不易被降解，因此RNA干擾不僅在體外，而且在動物體內(nèi)亦具有較好的效果；(4)篩選周期短針對某一基因的有效siRNA序列篩選的方法較簡單，因此研發(fā)周期較短。
RNAi在HIV的體外實驗中取得了較理想的結(jié)果。Rossi等將HIV-1編碼rev的基因和與它同源的雙鏈RNA共轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，rev基因的表達(dá)被顯著抑制；同時將siRNA的抑制效應(yīng)與反義RNA和核酶等進(jìn)行了比較，發(fā)現(xiàn)只有siRNA組抑制了HIV rev-EGFP的表達(dá)，其抑制率達(dá)到90％，遠(yuǎn)優(yōu)于反義RNA和核酶組，這一結(jié)果同樣被Novina等學(xué)者所證實。Novina等用針對CD4的dsRNA能將細(xì)胞表面HIV病毒的受體表達(dá)減少75％，從而抵抗HIV病毒的感染。因此，針對病毒基因的siRNA是慢性病毒性感染的最佳治療策略，具有廣闊的應(yīng)用前景。
慢性乙型肝炎是我國的高發(fā)疾病之一，是導(dǎo)致肝纖維化和肝癌的主要原因。目前治療乙型肝炎的藥物主要是以α干擾素為主的免疫調(diào)節(jié)劑和以拉米呋啶、阿德福韋為主的核苷類似物，但治療效果仍不滿意。HBV DNA的持續(xù)復(fù)制是導(dǎo)致乙型肝炎慢性化的主要原因。因此有效抑制HBV DNA復(fù)制，是治療慢性乙型肝炎和控制HBV持續(xù)感染的關(guān)鍵。
HBV DNA的復(fù)制是一個DNA-RNA-DNA的過程，其中前基因組RNA含有病毒DNA上全部遺傳信息，是子代病毒前基因組反轉(zhuǎn)錄的模板。如果能夠特異性阻斷HBV前基因組RNA的逆轉(zhuǎn)錄及3.5kb，2.4kb，2.1kb和0.9Kb四種未剪切mRNA的翻譯表達(dá)，將有效抑制HBVcccDNA在肝細(xì)胞中的再生成和子病毒的產(chǎn)生。因為HBV前基因組RNA的逆轉(zhuǎn)錄及未剪切mRNA的翻譯過程均發(fā)生在細(xì)胞漿，容易受到針對靶序列的siRNAs的攻擊而特異性地降解，所以本專利利用RNA干擾技術(shù)特異性降解HBV RNAs，達(dá)到抗HBV的作用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是根據(jù)siRNA的設(shè)計原理，提供針對HBV(ayw亞型)S基因的siRNA的cDNA靶序列。根據(jù)cDNA靶序列，化學(xué)合成法合成siRNA。這2條siRNA分別和報告質(zhì)粒pGFP-S共轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞后，可抑制報告基因綠熒光蛋白的表達(dá)；這2條siRNA轉(zhuǎn)染HepG2.2.15細(xì)胞后，可有效抑制HBsAg的表達(dá)。因此，針對HBV(ayw亞型)S基因的siRNA，可抑制HBsAg的表達(dá)，可在制備治療HBV慢性感染的藥物中應(yīng)用。
本發(fā)明提供針對HBV(ayw亞型)S基因的2條siRNA的目標(biāo)cDNA靶序列為SEQ ID NO.1(anti-s siRNA1)5’-AAACCTTCGGACGGAAATTGC-3’SEQ ID NO.2(anti-s siRNA2)5’-AATACCGCAGAGTCTAGACTC-3’具體實施方式
本發(fā)明結(jié)合實施例作進(jìn)一步說明。
實施例一 合成干擾RNA體外抑制HBV表面抗原融合基因的表達(dá)1.siRNA的設(shè)計 根據(jù)siRNA的設(shè)計原理，從轉(zhuǎn)錄本AUG起始密碼子開始，搜尋HBV ayw亞型的S基因中的AA序列，記錄跟每個AA 3’端相鄰的19nt作為候選的siRNA靶位點(diǎn)，選擇GC含量在40-55％的siRNA序列，通過Genebank的數(shù)據(jù)庫的Blast分析，將潛在的序列和相應(yīng)的人基因組數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比較，排除那些和其他編碼序列/EST同源的序列，設(shè)計針對HBV(ayw亞型)S基因的2條siRNA的目標(biāo)cDNA靶序列。序列如下(anti-s siRNA1)5’-AAACCTTCGGACGGAAATTGC-3’(anti-s siRNA2)5’-AATACCGCAGAGTCTAGACTC-3’
2.siRNA的化學(xué)合成和雙鏈退火 根據(jù)siRNA設(shè)計原則，分別合成anti-ssiRNA1和anti-s siRNA2的正義鏈和反義鏈如下。每條鏈的5’端為磷酸鹽，3’端羥基化，有兩個堿基外懸，通過化學(xué)合成而得。形成雙鏈siRNA的退火處理正義鏈和反義鏈各20μM，加入退火緩沖液(100μM KAc，30mM HEPES-KOH，pH7.4，2mM MgAc2)，90℃水浴1min，37℃水浴1h。
anti-s siRNA15’-ACCUUCGGACGGAAAUUGCdTdT-3’(sense siRNA)5’-GCAAUUUCCGUCCGAAGGUdTdT-3’(antisense siRNA)anti-s siRNA25’-UACCGCAGAGUCUAGACUCdTdT-3’(sense siRNA)5’-GAGUCUAGACUCUGCGGUAdTdT-3’(antisense siRNA)3.anti-s siRNA抑制報告質(zhì)粒pGFP-S和siRNA共轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞的綠熒光蛋白表達(dá)和HBV S基因表達(dá)的實驗(1)報告質(zhì)粒pGFP-S和siRNA共轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞 報告質(zhì)粒pGFP-S是表達(dá)報告基因綠熒光蛋白和HBsAg融合蛋白的質(zhì)粒。HepG2細(xì)胞按照1×105/孔接種24孔板，培養(yǎng)24小時后達(dá)到80％-90％融合率，共轉(zhuǎn)染pGFP-S和siRNA，具體步驟參照Invitrogen公司Lipofectamine2000說明書。6小時后換10％FCS DMEM，同時設(shè)置只轉(zhuǎn)染pGFP-S載體的陰性組，每組重復(fù)3孔。
(2)熒光顯微鏡觀察細(xì)胞綠熒光蛋白表達(dá) 轉(zhuǎn)染48小時后，在倒置熒光顯微鏡(DM IRB，Leica)下觀察綠熒光蛋白在HepG2細(xì)胞中的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，與pGFP-S載體的陰性組相比，轉(zhuǎn)染pGFP-S和anti-S siRNA的HepG2細(xì)胞的熒光強(qiáng)度減弱，熒光細(xì)胞數(shù)減少。
(3)流式細(xì)胞儀觀察細(xì)胞綠熒光蛋白表達(dá) 轉(zhuǎn)染48小時后，常規(guī)消化HepG2細(xì)胞，離心懸液，重懸于PBS，流式細(xì)胞儀檢測表達(dá)熒光蛋白的陽性細(xì)胞數(shù)比例和平均熒光強(qiáng)度。結(jié)果顯示，與pGFP-S載體的陰性組相比，轉(zhuǎn)染pGFP-S和siRNA的HepG2的陽性細(xì)胞數(shù)比例降低，平均熒光強(qiáng)度降低。
(4)逆轉(zhuǎn)錄-實時熒光定量PCR法檢測HBV S基因RNA的表達(dá) RNA準(zhǔn)備轉(zhuǎn)染72小時后，收獲HepG2細(xì)胞，Trizol法抽提RNA，方法參照Invitrogen公司說明書。逆轉(zhuǎn)錄，過程參照MBI操作說明書。
熒光染料法定量PCR，上游引物5′-CTCACAATACCGCAGAGTC-3′；下游引物5′-TAAACTGAGCCAGGAGAAA-3′；
內(nèi)參照GAPDH，上游引物5′-ACAGTCAGCCGCATCTTCTTT-3′，下游引物5′-GCAACAATATCCACTTTACCAGAG-3′。PCR條件為95℃3min，再94℃30s，56℃ 30s，72℃ 45s，25個循環(huán)，熒光檢測點(diǎn)選擇72℃。同時做陽性對照(直接以pGFP-S質(zhì)粒DNA為模板組)和陰性對照(不加模板組)。實時定量PCR在25循環(huán)定點(diǎn)檢測顯示，與陰性對照相比，anti-S siRNA1和anti-S siRNA2對S基因的抑制率均達(dá)到50％以上。
4.anti-s siRNA抑制對siRNA轉(zhuǎn)染HepG2.2.15細(xì)胞的HBsAg和HbeAg表達(dá)的實驗(1)siRNA轉(zhuǎn)染HepG2.2.15細(xì)胞 HepG2.2.15細(xì)胞按照1×104接種24孔板，培養(yǎng)24小時后達(dá)到30％-40％融合率，轉(zhuǎn)染siRNA各0.84μg，具體步驟參見Invitrogen公司OLIGOFECTAMINE試劑說明書。設(shè)置無關(guān)對照siGFP組(FEBS Letters 543(2003)51-54)sense RNA 5-GGCUACGUCCAGGAGCGCACC-3，anti-sense RNA 5-UGCGCUCCUGGACGUAGCCTT-3。6小時后換10％FCS DMEM。每組設(shè)3個復(fù)孔。
(2)放射免疫法檢測HBsAg和HBeAg濃度變化 轉(zhuǎn)染HepG2.2.15細(xì)胞后第48h，分別收集細(xì)胞培養(yǎng)液，離心去除細(xì)胞碎片，上清進(jìn)行放射免疫法檢測，檢測方法參見試劑盒說明。轉(zhuǎn)染anti-S siRNA1和anti-S siRNA2后，HepG2.2.15細(xì)胞上清中的HBsAg和HBeAg的濃度較HepG2.2.15細(xì)胞低，anti-SsiRNA1和anti-S siRNA2對HBsAg和HBeAg的抑制率均達(dá)到50％以上。
本發(fā)明是結(jié)合最佳實施例進(jìn)行描述的，然而在閱讀了本發(fā)明的上述內(nèi)容后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。
權(quán)利要求
1.針對乙肝病毒基因的siRNA序列，SEQ ID NO.1為anti-s siRNA1的核苷酸序列AAACCTTCGG ACGGAAATTG C 21。
2.針對乙肝病毒基因的siRNA序列，SEQ ID NO.2為anti-s siRNA2的核苷酸序列AATACCGCAG AGTCTAGACT C 21。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的針對乙肝病毒基因的siRNA序列，是針對乙肝病毒ayw亞型S基因的目標(biāo)cDNA靶序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的針對乙肝病毒基因的siRNA序列在制備抑制乙肝病毒復(fù)制藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提供針對乙肝病毒基因的2條siRNA的cDNA靶序列，SEQ ID NO.1為anti－s siRNA1的核苷酸序列，SEQ ID NO.2為anti－s siRNA2的核苷酸序列。這2條siRNA分別和報告質(zhì)粒pGFP－S共轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞后，可抑制報告基因綠熒光蛋白的表達(dá)；這2條siRNA轉(zhuǎn)染HepG2.2.15細(xì)胞后，可有效抑制HBsAg的表達(dá)。因此，針對HBV(ayw亞型)S基因的2條siRNA，可抑制HBsAg的表達(dá)，可在制備HBV慢性感染的治療藥物中應(yīng)用。
文檔編號A61P1/00GK1637142SQ200410089168
公開日2005年7月13日 申請日期2004年11月29日 優(yōu)先權(quán)日2004年11月29日
發(fā)明者陳智, 羊正綱, 朱海紅 申請人:浙江大學(xué)